English

• 1.   引 言

  烟草特有亚硝胺(TSNAs)是卷烟烟气中诱发癌症的主要活性成分之一,其中4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)是4种烟草特有N-亚硝胺中致癌活性最强的一种^[1～3]。我国也将NNK列为烟气安全性评价的重要指标之一^[4]。因此,准确测定卷烟烟气中NNK的含量具有重要的意义。由于卷烟烟气中的烟草特有亚硝胺含量极微,特别是烤烟型卷烟。一般浓度均在ng/支 数量级,卷烟烟气又是非常复杂的混合物,因此卷烟烟气中的烟草特有N-亚硝胺的定量分析有相当大的难度。目前,检测卷烟烟气中TSNAs的分析方法主要有气相色谱-热能分析仪法(GC-TEA)^{[5, 6]}、气相色谱-质谱联用法(GC/MS)^[7～9]和液相色谱-多级质谱联用法(LC-MS/MS)^[10～15]等。TEA是专一性的检测器,只对亚硝胺和亚硝酸酯响应,对于TSNAs具有很好的选择性。但是目前新型号的热能分析仪由于接口的原因导致色谱峰扩散,其灵敏度反而较低,测定烤烟型卷烟中低含量的TSNAs存在较大的困难。GC/MS也因灵敏度的原因,一般只适用于TSNAs含量很高的卷烟烟气样品;LC-MS/MS灵敏度高,是现在国内外检测TSNAs的一种主流方法,但仪器维护昂贵,测定结果的精密度相对较差。因此开发操作简便,准确、灵敏的TSNAs分析方法非常迫切。

  在线液相-气相二维色谱是近几年来发展起来的新分析技术,样品先经液相色谱分离净化后,含待测组分的流出馏分在线切割进入气相色谱进行分析^[16～18]。液相色谱和气相色谱的在线联用能充分发挥两级色谱的互补性,一方面液相色谱的高柱效大大提高了样品的净化效果,能实现复杂基体中痕量待测成分与干扰物质的分离,而且二维色谱间在线切换还可减少样品前处理过程中的浓缩和转移,减少了人为分析误差,使分析结果的准确性、精密度大大提高^[16]。该技术在复杂基体中的痕量有机化合物分析领域得到了广泛应用^[16]。考虑到卷烟主流烟气中NNK的测定采用碱性氧化铝柱色谱净化,气相色谱-热能检测中(Coresta推荐方法和中国的国标)^[5],样品前处理过程需使用大量有机溶剂,多次的转移、浓缩,操作非常麻烦。本研究对岛津公司的在线凝胶气质联用仪进行了改进,自主装填了微型碱性氧化铝柱,并用该柱替换了仪器上的微型凝胶柱,让样品经过氧化铝柱净化后再进入气质联用分析,建立一种在线液相-气相二维色谱测定卷烟主流烟气中NNK的方法,方法简便、快速,结果令人满意,为卷烟主流烟气中NNK的测定提供了新方法。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  在线GPC (LC-20AD)-GC/MS (QP [2010] Plus)联用仪(日本岛津公司);RM20H转盘型吸烟机(英国CERULEAN公司)。

  二氯甲烷、无水甲醇(色谱纯,美国Fisher公司);4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮 (NNK) (纯度≥98%)、D4-NNK(百灵威化学试剂有限公司)。微型氧化铝柱:球形氧化铝(50 mm × 2.0 mm,3-5 μm,德国Mecker公司),采用匀浆法装填成色谱柱。

  2.2.   实验方法

  2.2.3.   卷烟主流烟气的捕集、处理和分析

  卷烟样品在(22±1)℃、相对湿度60%±2%条件下平衡48 h,挑选平均重量±0.02 g和平均吸阻±[49] Pa范围内的烟支作为实验样品。采用RM20H转盘型吸烟机参照GB/T5606.1-2004^[19]、GB/T19609^[20]的规定,用92 mm剑桥滤片捕集20支烟的主流烟气总粒相物。将滤片放入100 mL锥形瓶中,加入20 mL含内标的萃取液,超声萃取40 min,静置待用。萃取液经0.25 μm滤膜过滤后进行检测。

  液相色谱配紫外检测器(λ=254 nm);色谱柱为自主装填氧化铝柱(50 mm×2.0 mm,3-5 μm);柱温30℃;流动相为二氯甲烷-丙酮(9∶1,V/V),流速0.1 mL/min;双泵系统,泵A用于控制色谱柱流量,泵B用于控制HPLC与GC之间的切换。液相色谱进样量为40μL,收集时间为5.2～7.0 min,并通过泵B和切换阀全部在线切换到GC的进样口。

  GC/MS: GC带柱头大体积进样附件(见图 1),保留间隙柱为5 m × 0.53 mm i.d. 的空柱,预柱:DB-[5] MS (5 m ×0.25 mm × 0.25 μm);分析柱:HP-5MS (30 m × 0.25 mm×0.25 μm);载气:氦气,纯度≥99.999%;流量:1.2 mL/min;进样口温度250℃;色谱柱升温程序:初始温度150℃,保持1 min,以20℃/min速率升至190℃,再以2℃/min速率升至250℃,保持20 min。

  质谱条件:电离方式:EI源;电离能量:30 eV;离子源温度:250℃;四级杆温度:120℃;扫描模式:选择离子检测(SIM)模式,NNK与D4-NNK的定量离子分别为m/z 177和181。

  2.2.1.   在线液相-气相二维色谱分析

  在线液相-气相二维色谱装置结构示意图如图 1所示,样品和流动相通过泵A输送至色谱柱分离,所需要的馏分(含NNK的部位)通过数控六通阀转入捕集盘管,泵A流动相废液从六通阀6排出,捕集盘管中所需要的馏分经泵B输送到气相色谱预柱中,在气相色谱预柱和分析柱之间有溶剂排出阀,样品真空蒸发排出溶剂后,再升温气化由载气输送进入分离柱,经分离柱分离后再通过质谱检测。

  图 1

  

  图 1  在线液相-气相二维色谱分析示意图

  Figure 1.  On-line coupled liquid chromatography-gas chromatography system

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.2.2.   标准溶液的配制

  NNK标准储备液:用二氯甲烷作溶剂,配制浓度为1000 μg/L NNK标准储备液,使用时按需求稀释成所需浓度的标准工作溶液。

  萃取液:配制内标(D4-NNK)浓度为20 μg/L二氯甲烷萃取液。

  3.   结果与讨论

  3.1.   萃取方式和萃取时间的确定

  在用气相色谱测定NNK的方法中,一般都用二氯甲烷作为样品的萃取溶剂,前人对萃取条件进行过大量的研究。因此,本实验中也选用二氯甲烷作为萃取溶剂。采用超声萃取法,萃取时间在40 min时NNK的溶出量趋于稳定,延长萃取时间对NNK的释放量没有明显的影响,所以本实验选择超声萃取时间为40 min。

  3.2.   液相色谱柱的选择

  考虑到卷烟主流烟气中NNK的测定采用碱性氧化铝色谱净化,本实验采用氧化铝柱 (50 mm × 2.0 mm,3-5 μm) 为液相色谱的分离柱,0.1 mL/min的流量,与常规的氧化铝柱色谱净化相比,可大大节约有机流动相。由于NNK和卷烟烟气中的主要共存物 (酚类、烟碱类似物、烃类等) 极性差异比较大,用碱性氧化铝正相色谱能分离大部分的干扰组分,从而实现样品的净化。

  考虑到从液相色谱切入气相色谱的馏分需排除溶剂后才能进行气相色谱分析,液相色谱需采用易挥发的流动相,因此本实验中采用二氯甲烷与丙酮作为流动相,当二氯甲烷和丙酮的体积比为9∶1 时,NNK有较好的净化效果,因此实验选用该流动相,流速为0.1 mL/min,出峰时间为5.8～ 6.4 min之间 (图 2),为了使样品中的待测组分尽可能完全收集,本实验选择收集时间为5.2 ～7.0 min。

  图 2

  

  图 2  NK在液相色谱柱上分离的色谱图

  Figure 2.  Liquid chromatogram of 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyriyl)-1-butanone (NNK)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.3.   GC-MS条件的选择

  对色谱和质谱条件分别进行了优化,色谱条件主要对升温程序进行了优化,比较了不同升温程序的分离效果,以NNK完全分离并尽可能缩短分析时间为目标,最终选择了实验方法中的升温程序。以NNK达到最高响应为目标,对质谱条件进行了优化,最终选择离子源温度250℃,传输线温度250℃,扫描质量范围m/z 50-300,扫描间隔0.5 s。采用从总离子流图提取单离子的方法进行定量,NNK定量离子为m/z 177,D4-NNK内标特征离子为m/z 181。在选定条件下,实际样品的色谱图见图 3。

  图 3

  

  图 3  NNK标样(a)和卷烟主流烟气样品(b)气相色谱图

  Figure 3.  Gas chromatogram of (a) standard sample of NNK and (b) mainstream cigarette smoke sample

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.4.   工作曲线、检出限和定量下限

  配制不同浓度的系列标准工作液按选定仪器条件进样,以标准溶液与内标溶液的质量浓度比对峰面积比制作工作曲线。标准曲线的每一点进样3次,取其峰面积的平均值,峰面积为纵坐标,标样浓度为横坐标,绘制线性回归曲线,回归方程A=2.87C (ng/mL) + 0.0126,相关系数为0.9998,线性范围为1.2-120 ng/mL。对最低浓度的NNK标准溶液进行10次测定,计算其标准偏差,以3倍标准偏差作为检出限为0.25 ng/mL。

  3.5.   回收率和重复性

  选择国内一种烤烟型卷烟样品4份,其中1份为参比,另3份分别加入高、中、低不同浓度水平的NNK,样品按选定的前处理条件处理,选定色谱条件进样分析,得到NNK的回收率在93.9%-96.0%之间 (表 1),说明方法回收率较好。将该牌号的卷烟样品重复分析7次,测得NNK的相对标准偏差(RSD)为3.3%(表 1),表明方法的重复性良好,满足日常烟气样品的检测。

  表 1

  

  表 1  卷烟样品主流烟气中NNK的回收率

  Table 1.  Recovery of NNK in mainstream cigarette smoke of cigarette sample

  下载: 导出CSV

  释放量Content(ng/cig)	加标量Added(ng/cig)	测定值Found(ng/cig)	回收率Recovery(%)
  5.26	2	6.94	93.9
  5.26	5	10.04	95.8
  5.26	10	15.05	96.0

  3.6.   卷烟样品主流烟气中NNK分析结果

  采用本方法和中国烟草总公司企业标准YQ/T 17-2012中规定的方法[JP2]对8个不同类型市售烤烟型卷烟样品进行测定,结果见表 2。由表 2可知,采用本方法的测定结果与国标方法YQ/T 17-2012的分析结果具有较好的一致性,说明本方法准确可靠。

  表 2

  

  表 2  8种烤烟型卷烟样品中NNK的测定结果

  Table 2.  Determination results of NNK in 8 kinds of flue-cured cigarette samples

  下载: 导出CSV

  No.	盒标焦油量Box of the tar(mg/cig)	NNK释放量 Contents of NNK (ng/cig)
  		本方法This method	GB/T21130-2007方法GB/T21130-2007 method
  1	8	6.84	6.67
  2	8	5.27	5.54
  3	8	6.02	6.31
  4	10	4.87	4.92
  5	10	5.18	4.73
  6	10	6.24	6.42
  7	12	6.60	6.39
  8	12	4.87	5.02

  4.   结 论

  本研究自主装填了微型氧化铝柱,基于在线液相-气相二维色谱联用技术,建立了测定卷烟主流烟气中NNK的新方法。采用微型氧化铝柱净化减少了溶剂消耗和环境污染,降低了实验成本。每次进样可达40 μL,与常规气相色谱相比,进样量扩大了20倍以上,灵敏度也大大得到提高,同时避免了样品处理过程中的浓缩、转移、定容等前处理步骤,减少了实验误差,由于样品处理人工操作环节大大减少,方法的重现性和灵敏度明显提高。

• 1. [1]

     Hoffmann D, Rivenson A, Chung F L, Hechta S S. Critical Rev. Toxicol., 1991, 21(4): 305-311

  2. [2]

     Hecht S S. J. National Cancer Inst., 1999, 91(14): 1194-1210

  3. [3]

     Hoffmann D, Brunnemann K D, Prokopczyk B, Prokopczykb B, Djordjevicb M V. J. Toxicol. Environ. Health A, 1994, 41(1): 1-52

  4. [4]

     XIE Jian-Ping, LIU Hui-Min, ZHU Mao-Xiang, ZHONG Ke-Jun, DAI Ya, DU Wen, XIE Fu-Wei, MIAO Ming-Ming, DENG Jia-Yun, NIE Cong, SHAO Xue-Guang, HU Qing-Yuan, YAO Xiao-Jun, LI Zhong, ZHANG Xiao-Bing. Tobacco Science & Technology, 2009, (2): 5-15谢剑平, 刘惠民, 朱茂祥, 钟科军, 戴 亚, 杜 文, 谢复炜, 缪明明, 邓家云, 聂 聪, 邵学广, 胡清源, 姚小军, 李 忠, 张晓兵. 烟草科技, 2009, (2): 5-15

  5. [5]

     GB/T 23228-2008. Cigarette-Determination of Tobacco Specific N-Nitrosamines in Total Particulate Matter of Mainstream Cigarette Smoke-GC-TEA Method 卷烟 主流烟气总粒相物中烟草特有N-亚硝胺的测定 气相色谱-热能分析联用法. 中华人民共和国国家标准. GB/T 23228-2008

  6. [6]

     XIE Fu-Wei, JIN Yong-Ming, ZHAO Ming-Yue, WANG Sheng, LIU Ke-Jian, Su Qing-De. Acta Tabacaria Sinica, 2004, 10(5): 8-15谢复炜, 金永明, 赵明月, 王 昇, 刘克建, 苏庆德. 中国烟草学报, 2004, 10(5): 8-15

  7. [7]

     Song S, Ashley D L. Anal. Chem., 1999, 71(7): 1303-1308

  8. [8]

     Wu D, Lu Y, Lin H, Zhou W, Gu W. J. Sep. Sci., 2013, 36(16): 2615-2620

  9. [9]

     GU Wen-Bo, ZHOU Wan-Hong, LU Yi-Feng, LIN Hua-Qing, WU Da. Tobacco Science & Technology, 2013, (10): 40-48顾文博, 周宛虹, 陆怡峰, 林华清, 吴 达. 烟草科技, 2013, (10): 40-48

  10. [10]

      DING Shi-Chao, DU Wen, REN Jian-Xin, QIAN Xiao-Chun, LIU Jian-Fu. Acta Tabacaria Sinica, 2006, 11(6): 17-22丁时超, 杜 文, 任建新, 钱晓春, 刘建福. 中国烟草学报, 2006, 11(6): 17-22

  11. [11]

      ZHU Wen-Jin, YANG Jun, LIU Bai-Zhan, SU Qing-De, LU Yi-Feng, ZHOU Wan-Hong. Journal of Instrumental Analysis, 2010, 1: 26-30朱文静, 杨 俊, 刘百战, 苏庆德, 陆怡峰, 周宛虹. 分析测试学报, 2010, 1: 26-30

  12. [12]

      WANG Zhao-Yu, WANG Sheng, WANG Juan, LU Bin-Bin, LIU Ke-Jian, ZHANG Jian-Xun. Tobacco Science & Technology, 2010, (6): 57-67王兆宇, 王 昇, 王 娟, 卢斌斌, 刘克建, 张建勋. 烟草科技, 2010, (6): 57-67

  13. [13]

      Wu W, Ashley D L, Watson C H. Anal. Chem., 2003, 75(18): 4827-4832

  14. [14]

      WU Ming-Jian, HU Nian-Nian, LI Yong, SUN Xian-Jun, CHEN Xiao-Ming. Tobacco Science & Technology, 2007, 243(10): 41-45吴名剑, 胡念念, 李 勇, 孙贤军, 陈小明. 烟草科技, 2007, 243(10): 41-45

  15. [15]

      ZHANG Feng-Mei, YANG Liu, MENG Zhao-Yu, WU Yi-Qin, YI Ao-Er, MOU Ding-Rong. Chemistry and Bioengineering, 2012, 29(3): 92-94张凤梅, 杨 柳, 孟昭宇, 吴亿勤, 伊奥尔, 牟定荣. 化学与生物工程, 2012, 29(3): 92-94

  16. [16]

      Hyötyläinen T, Riekkola M L. J. Chromatogr. A, 2003, 1000, 357-384

  17. [17]

      Biedermann M, Grob K. J. Chromatogr. A, 2012, 1255: 56-75

  18. [18]

      Purcaro G, Moret S, Conte L. J. Chromatogr. A, 2012, 1255: 100-111

  19. [19]

      GB/T 5606.1-2004. Cigarette Part 1: Sampling 卷烟 第1部分 抽样. 中华人民共和国国家标准. GB/ T 5606. 1-2004

  20. [20]

      GB/ T 19609-2004, Cigarette-Total Particle Phase is Measured by Routine Analysis Using Smoking Machine and Tar Content卷烟 用常规分析用吸烟机测定总粒相物和焦油. 中华人民共和国国家标准. GB/ T 19609-2004

• 

  Figure 1  On-line coupled liquid chromatography-gas chromatography system

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 2  Liquid chromatogram of 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyriyl)-1-butanone (NNK)

  2.0 min为溶剂峰(Peak at 2.0 min: solvent peak)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 3  Gas chromatogram of (a) standard sample of NNK and (b) mainstream cigarette smoke sample

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  Table 1.  Recovery of NNK in mainstream cigarette smoke of cigarette sample

  释放量Content(ng/cig)	加标量Added(ng/cig)	测定值Found(ng/cig)	回收率Recovery(%)
  5.26	2	6.94	93.9
  5.26	5	10.04	95.8
  5.26	10	15.05	96.0

  下载: 导出CSV

  Table 2.  Determination results of NNK in 8 kinds of flue-cured cigarette samples

  No.	盒标焦油量Box of the tar(mg/cig)	NNK释放量 Contents of NNK (ng/cig)
  		本方法This method	GB/T21130-2007方法GB/T21130-2007 method
  1	8	6.84	6.67
  2	8	5.27	5.54
  3	8	6.02	6.31
  4	10	4.87	4.92
  5	10	5.18	4.73
  6	10	6.24	6.42
  7	12	6.60	6.39
  8	12	4.87	5.02

  下载: 导出CSV
•