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复合免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中6种黄曲霉毒素和6种玉米赤霉醇类真菌毒素残留量

孙雪 ,  郗存显 ,  唐柏彬 ,  王国民 ,  陈冬东 ,  赵华

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引用本文: 孙雪,  郗存显,  唐柏彬,  王国民,  陈冬东,  赵华. 复合免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中6种黄曲霉毒素和6种玉米赤霉醇类真菌毒素残留量[J]. 分析化学, 2016, 44(6): 970-978. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.150229 shu
Citation:  XUE SUN,  XI Cun-Xian,  TANG Bo-Bin,  WANG Guo-Min,  CHEN Dong-Dong,  ZHAO Hua. Determination of Aflatoxins and Zeranols in Animal-Originated Foods by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Combined With Immunoaffinity Clean-up Column[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2016, 44(6): 970-978. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.150229 shu

复合免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中6种黄曲霉毒素和6种玉米赤霉醇类真菌毒素残留量

  • 1.

    西藏自治区人民医院药剂科, 拉萨 850000;

  • 2.

    重庆医科大学药学院, 重庆 400016;

  • 3.

    重庆出入境检验检疫局, 重庆市进出口食品安全工程技术研究中心, 重庆 400020;

  • 4.

    中国检验检疫科学研究院, 北京 100123

  • 基金项目:

    本文系科技部质检公益(No.201210086)项目和国家认监委检验检疫行业标准(No.2011B138)项目资助

摘要: 建立了动物源食品(猪肉、鱼肉、猪肝)中6种黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2)和6种玉米赤霉醇类真菌毒素(α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮)残留量的复合免疫亲和柱净化-高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)检测方法。样品经β-葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶酶解后,用甲醇-乙腈(20:80,V/V)提取,提取液经玻璃纤维滤纸过滤,滤液用PBS溶液稀释,复合免疫亲和柱富集和净化后,采用HPLC-MS/MS法分析。12种目标分析物中AFB2和AFG2的线性范围为0.03-6.0μg/L,其余目标分析物的线性范围为0.05-20μg/L,线性相关系数均大于0.999,检出限在0.01-0.03μg/kg范围内,定量限在0.04-0.09μg/kg范围内。分别以0.5,1.0和5.0μg/kg添加浓度水平进行方法学验证,平均回收率为73.6%-98.4%,相对标准偏差(RSD)为1.9%-11.2%。本方法简便、灵敏,能够满足动物源食品中痕量黄曲霉毒素和玉米赤霉醇类真菌毒素残留的测定要求。

English

  • 1.   引 言

    真菌毒素来源于各种霉菌的次生代谢产物,包含多种化学结构不同的物质。常见的真菌毒素包括T-2毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素、呕吐毒素等。玉米赤霉烯酮(ZON)是由镰刀霉菌产生的一种雷索酸内酯类真菌毒素,在肠道和肝脏经3α-和3β-羟基类固醇脱氢酶(HSDs)羟基化,生成α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL)、β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL),之后进一步还原生成α-玉米赤霉醇(α-ZAL)、β-玉米赤霉醇(β-ZAL)和玉米赤霉酮(ZAN)[1, 2],这几种物质与ZON合称为玉米赤霉醇类真菌毒素(Zeranol,ZER)。黄曲霉毒素(Aflatoxins,AFs)是由曲霉菌代谢产生的一组致毒基团相同、化学结构类似的真菌毒素,常见的有黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)等,其中AFB1和AFB2可在机体内代谢产生黄曲霉毒素M1(AFM1)以及黄曲霉毒素M2(AFM2)[3]。

    ZER及其代谢产物具有雌激素类物质的生物活性,能与雌激素受体相互作用,产生一系列的毒副作用,包括生殖毒性[4, 5]、遗传毒性[6]、基因毒性[7]、免疫毒性[8]等,还可影响机体内分泌系统,导致内分泌紊乱,影响激素调节水平[9, 10]。AFs对人和动物的健康具有严重的威胁,其毒性包括DNA损伤和基因突变[11]、致癌性[12]、免疫毒性[13]、生殖和生长毒性[14]等,其中AFB1毒性比砒霜大68倍,致癌性是3,4-苯并芘的4000倍[15],被国际癌症研究机构归为一类致癌物质。农业部2002年235号公告明确规定玉米赤霉醇在动物性食品中不得检出[16];食品中黄曲霉毒素多以AFB1和AFM1的形式检出,我国食品中AFB1的限量标准为0.5~20.0 μg/kg,AFM1的限量标准为0.5 μg/kg[17]。

    动物被喂食真菌毒素污染的谷物及饲料后,组织(如牛羊肉、动物肝脏等)中可能会残留真菌毒素,等通过食物链传给食用者,对其健康构成潜在危害。因此建立高灵敏度、特异性、简便、快速的毒素残留分析方法非常必要。目前,有关ZER和AFs的测定方法有酶联免疫分析法(ELISA)[18~20]、高效液相色谱法(HPLC)[21~23]、液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)[24~26]等。ELISA具有较好的特异性及敏感性,且操作简便、快速,但容易受到复杂基质的干扰,出现假阳性结果;HPLC虽无GC-MS的化学衍生化过程,但其灵敏度低、定性准确度不高;而HPLC-MS/MS可对多组分同时进行定性和定量分析,且具有专属性强、选择性好、灵敏度高等优势,弥补了前述方法的不足,使得该技术在分析检验中得到了广泛应用。

    与传统的液-液萃取和固相萃取相比,免疫亲和柱具有特异性好、净化能力好、富集能力强等优点,本实验室在前期研究中建立了免疫亲和柱测定动物源食品中磺胺类药物[27]、玉米赤霉醇类真菌毒素[21]残留量的检测方法,但由于动物源食品中常多种残留兽药,采用单一的免疫亲和柱一次仅能测定其中的某种或者某类药物的含量。为了满足动物源食品中不同种类兽药残留的同时测定要求,本研究组进行了复合免疫亲和柱在食品分析中的应用研究[28]。在此基础上,本研究建立了复合免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中6种黄曲霉毒素和6种玉米赤霉醇类真菌毒素残留量的方法,考察了复合免疫亲和柱的性能,优化了样品前处理方法。本方法的提取效率高,重现性好。相比本实验室前期建立的玉米赤霉醇类真菌毒素残留的检测方法,本研究采用复合免疫亲和柱,可同时对ZER和AFs两类物质富集净化;样品采用混合溶剂一步提取,更加简便、快速,检出限和定量限更低,方法更加灵敏。本方法为动物源食品中ZER和AFs的同时检测提供了重要参考。

    2.   实验部分

    2.1.   仪器和试剂

    UFLC XR液相色谱仪(日本Shimadzu公司),配LC-20AD输液泵、SIL-20AC自动进样器、CTO-20AC恒温箱; API4000串联质谱仪(美国ABsciex公司); BS224S型天平(德国Sartorius公司); 恒温培养振荡器(上海智诚ZHWY-ZHZB公司); 涡旋振荡混合器(江苏康健医疗用品有限公司); 3-30K台式高速冷冻离心机(德国 Sigma公司); 奥立龙828台式酸度计(美国奥立龙公司); N-EVAP116水浴式氮吹浓缩仪(美国Organomation Associates公司)。

    复合免疫亲和柱(IAC-SEP®IAC-AZ,柱容量1000 ng,2 mL,北京中检维康技术有限公司); β-葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶(H-2,from Helix pomatia) 浓度配比为134600 和5200 units/mL(美国Sigma 公司); 乙腈、甲醇(色谱纯,美国Tedia 公司); 无水乙醇(分析纯,重庆川东化工集团有限公司); 实验用水为Milli-Q 超纯水系统(美国Millipore 公司)制备的超纯水; 其它试剂均为分析纯。

    α-ZOL,β-ZOL,α-ZAL,β-ZAL,ZON,ZAN标准品(纯度≥98.0%,美国Sigma 公司); AFB1,AFB2,AFG1,AFG2混合标准溶液(纯度≥98.0%,浓度分别为1.0,0.3,1.0和0.3 mg/L,甲醇-苯(98∶2,V/V),上海安谱科学仪器有限公司); AFM1,AFM2(纯度≥98.5%,10 μg/mL,乙腈,美国Supelo公司)。

    2.2.   溶液的配制

    标准储备液:准确称取α-ZOL,β-ZOL,α-ZAL,β-ZAL,ZON,ZAN标准品,用甲醇溶解并稀释成浓度均为100 μg/mL的标准品储备液。AFM1,AFM2标准溶液用乙腈稀释,分别得到浓度均为1.0 μg/mL 的标准品储备液,置-20℃ 保存。

    混合标准品工作液:分别准确吸取玉米赤霉醇类真菌毒素各标准品储备液1.0 mL,用甲醇配制成浓度均为1.0 μg/mL的ZER混合标准品溶液。将AFB1,AFB2,AFG1和AFG2混合标准溶液全部移至10 mL容量瓶中,于40℃氮气下吹干后,加入少量甲醇溶解残渣,加入 AFM1和AFM2标准储备溶液各1.0 mL、ZER混合标准品溶液1.0 mL,混匀后,用甲醇定容,得到含有AFB1,AFG1,AFM1和AFM2浓度为100 μg/L,AFB2,AFG2浓度为30 μg/L,ZER浓度为100 μg/L的混合标准工作液,-20℃ 保存。再吸取适量混合标准溶液,用乙腈-水(25∶75,V/V)配制成质量浓度为0.05~20.0 μg/L(AFB2,AFG2为0.03~6.0 μg/L)的混合标准工作溶液,现配现用。

    基质匹配混合标准溶液:空白基质按照样品提取净化的步骤处理后,用系列混合标准工作溶液1 mL溶解残渣,涡旋混匀,过0.22 μm滤膜,供测定。

    NaAc-HAc缓冲液:称取6.80 g NaAC,用900 mL超纯水充分溶解,然后用醋酸调节至pH 5.0,并定容至1 L。

    磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4):分别称取2.90 g Na2HPO4·12H2O,8.00 g NaCl,0.20 g KCl和0.24 g KH2PO4,用900 mL超纯水溶解后,以1.0 mol/L NaOH溶液调节至pH 7.4,定容至1 L。

    2.3.   色谱-质谱条件

    色谱条件:色谱柱、流动相、梯度洗脱程序等具体的色谱条件见表 1。

    表 1

    表 1  目标分析物的液相色谱和质谱测定参数
    Table 1.  Liquid chromatography (LC) and mass spectrometry (MS) conditions for analaysis of target compounds
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    电离模式 Ionization mode
    ESI+modeESI~ mode
    色谱条件 LC condition色谱柱 ColumnShimadzu Shim-pack VP-ODS(150 mm×2.0 mm,5 μm)
    流动相 Mobile phaseA: 乙腈acetonitrile B: 2 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.2%甲酸)2 mmol/L ammonium acetate containing 0.2% formic acid
    进样体积 Injection volume10 μL10 μL
    梯度洗脱程序 Gradient listTime(min) 0 2 7 9 9.5 10 A(%) 10 10 90 90 10 10 B(%) 90 90 10 10 90 90Time(min) 0 7 7.5 8 A(%) 70 70 25 25 B(%) 30 30 75 75
    质谱条件 MS Condition电喷雾压力 Electrospray voltage(IS)5500 V-4500 V
    雾化器压力 Atomization gas pressure (GS1)482 kPa241 kPa
    气帘气压力 Air curtain gas pressure (CUR)207 kPa276 kPa
    辅助气压力 Auxiliary air pressure(GS2)414 kPa414 kPa
    入口电压 Collision chamber inlet voltage(EP)4.5 V-4.5V
    离子源温度 Temperature600℃550℃

    质谱条件:ZER采用电喷雾负离子-多反应监测检测(ESI--MRM); AFs采用电喷雾正离子-多反应监测检测(ESI+-MRM)。电喷雾电压(IS)、雾化气压力(GS1)、气帘气压力(CUR)、辅助气压力(GS2)等质谱参数见表 1; 出口电压(CXP)、碰撞电压(CE)、去簇电压(DP)等参数见表 2。

    表 2

    表 2  测定玉米赤霉醇类真菌毒素(ZER)和黄曲霉毒素(AFs)的ESI-MRM参数
    Table 2.  ESI-MRM conditions for determination of zeranols (ZER) and aflatoxins (AFs)
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    分析物 Analyte母离子 Parent ion (m/z)子离子 Daughter ions (m/z)碰撞电压 Collision potential (V)去簇电压 Declustering potential (V)入口电压 Entrance potential (V)出口电压 Collision cell cxit potential (V)
    ZON317.2175.0*,273.0-35,-28-80-8-15,-8
    β-ZAL321.2277.2*,303.2-31,-29-83-10-6,-17
    ZAN319.1275.0*,301.0-31,-35-80-8-15,-15
    α-ZOL319.2275.0*,301.0-31,-31-81-8-19,-19
    α-ZAL321.2277.2*,303.2-31,-29-83-10-6,-17
    β-ZOL319.2275.0*,301.0-31,-31-81-8-19,-19
    AFB1313.2241.1*,285.351,35781122,25
    AFB2315.2259.1*,287.140,36771214,16
    AFG1329.1243.3*,283.236,35901114,14
    AFG2331.1217.3*,245.349,40601412,14
    AFM1329.1273.1*,259.233,35641215,16
    AFM2331.1273.1*,285.133,526311,1018,12
    "*" 定量离子对(Quantitative ion pair) 。ZON: Zearalenone; ZAL: Zeranol; ZAN: Zearalanone; ZOL: Zearalenol; AF6: Aflatoxins.

    2.4.   样品前处理

    2.4.3.   免疫亲和柱净化

    放干IAC-AZ柱体内溶液,与10 mL注射器连接。将上述待净化液以每秒约1滴的速度通过IAC-AZ柱,待全部通过后,分别用5.0 mL PBS和5.0 mL水以每秒约1~2滴的速度淋洗,待淋洗液完全通过柱子后,弃去流出液,抽干柱体残留的液体。用3.0 mL乙腈以每秒约1滴的速度洗脱柱子,收集洗脱液,于40℃下氮气挥干,用1.0 mL 25%乙腈溶解残渣,过0.22 μm有机滤膜,滤液供LC-MS/MS分析。

    2.4.2.   样品的提取

    称取匀质后样品2.00 g于50 mL具塞离心管中,加入5.0 mL NaAC-HAc缓冲液和30 μL β-葡萄糖苷酸/硫酸酯复合酶,涡旋混匀。37℃下恒温振荡(100 r/min)酶解16 h,冷却至室温后加入15 mL甲醇-乙腈(20∶80,V/V),1.0 g NaCl,匀质提取2 min,加入5 g无水MgSO4,7500 r/min离心5 min,上清液过玻璃纤维滤纸,取滤液3 mL,用PBS稀释并定容至15 mL,待净化。

    2.4.1.   样品的制备

    从本地超市购买新鲜的猪肉、鱼肉、猪肝样品各500 g,捣碎匀质后装入洁净的密封袋中密封,于-18℃保存。

    3.   结果和讨论

    3.1.   样品前处理条件的优化

    3.2.   基质效应的评价

    本研究采用空白基质溶液和标准溶液分别配制相同浓度的基质效应曲线,基质效应ME(%)如下式[32]。

    其中K1和K2分别为基质匹配标准溶液所作曲线的斜率和无基质标准溶液所作曲线的斜率。对12种真菌毒素进行基质效应的评价,结果表明:猪肉中各分析物的基质效应值在-4%~2%之间,鱼肉中各分析物的基质效应值在-12%~7%之间,肝脏中各分析物的基质效应在-1%~13%之间,均在±15%以内,表明样品经免疫亲和柱净化后没有明显的基质效应,可以用无基质标准溶液制作标准曲线,采用外标法定量。

    3.3.   方法验证

    3.4.   实际样品分析

    利用本方法对市售的猪肉、鱼肉、猪肝各5批样品中6种玉米赤霉醇类真菌毒素和6种黄曲霉毒素进行了检测,其中1个猪肝样品中检测出AFB1,含量为0.27μg/kg,其余均未检出,阳性样品色谱图如图 2。参照国家标准《食品中黄曲霉毒素 M1和 B1的测定》[33]检测出AFB1含量为0.24 μg/ kg,两种方法的检出结果基本一致。

    图 2

    图 2  空白样品(左)及阳性样品(右)多反应检测图
    Figure 2.  Chromatograms of blank sample(left)and positive sample (right)
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    3.1.2.   柱洗脱剂的选择

    取0.5 mL 1 μg/L混合标准溶液,用PBS稀释至10 mL,上柱、淋洗后,分别用6 mL的甲醇、乙腈、无水乙醇作为洗脱剂进行洗脱,收集洗脱液进行分析。结果表明,5 mL水和5 mL PBS淋洗柱子,能够洗脱杂质且无目标分析物洗脱,当使用乙腈作为洗脱剂时,各目标待测物的洗脱率大于90%,故本实验最终选定乙腈作为柱洗脱剂。随着乙腈的用量增加,目标物的回收率随之提高,当乙腈体积大于3 mL 时,回收率趋于稳定。因此,本方法采用3 mL乙腈作为柱洗脱液。

    3.1.1.   待净化溶液中有机相的含量

    考察了待净化溶液中有机相含量对IAC-AZ柱富集效果的影响。结果表明,当有机相含量≤20%时,ZER和AFs的回收率无明显差别;当有机相含量＞20%时,随着有机相含量的增加,ZER和AFs的回收率明显下降。因此,待净化上载溶液中有机相的含量控制在20%以内。

    3.1.3.   提取溶剂的选择

    玉米赤霉醇及其类似物为脂溶性物质,不溶于纯水,溶于碱性水溶液和大多数有机溶剂,文献报道的常用提取溶剂有乙醚、乙腈、叔丁基甲醚等[21, 29]。黄曲霉毒素类真菌毒素难溶于水,易溶于油及甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂,文献报道的常用提取溶剂为甲醇-水或者乙腈-水的混合溶剂[30, 31],本实验在样品中添加5 μg/kg 目标物,比较了甲醇、乙腈、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈的提取效率(图 1)。结果表明,单一溶剂的提取效率都不理想,甲醇-乙腈(20∶80,V/V)的提取效果较好,12种目标待测物的提取回收率均大于90%。

    图 1

    图 1  不同溶剂对基质中ZER 和AFs 的提取回收率
    Figure 1.  Extraction recoveries of ZER and AFs in matrices with different solvents
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    3.3.2.   方法的回收率和精密度

    称取空白猪肉(或鱼肉、猪肝)样品,分别添加相当于0.5、1.0和5.0 μg/kg浓度水平的混合标准工作液,涡旋混匀后,按照2.4节处理后测定。每个添加水平重复6次,计算平均回收率和精密度。由表 4可知,猪肉基质中12种目标待测物的平均回收率为78.5%~98.4%,相对标准偏差为4.3%~11.2%;鱼肉基质中12种目标待测物的平均回收率为73.6%~97.8%,相对标准偏差为1.9%~9.1%;肝脏基质中12种目标待测物的平均回收率为79.2%~96.7%,相对标准偏差为2.5%~10.2%。结果表明,本方法在不同基质中均有较好的回收率和精密度,适用于不同基质中痕量ZER和AFs的检测。

    表 4

    表 4  猪肉、猪鱼肉、猪肝中ZER和AFs的回收率和精密度 (n=6)
    Table 4.  Recovery and precisions for ZER and AFs in pork,fish,swine liver (n=6)
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    分析物 Analyte基质 Matrix添加水平 Spiked level 0.5 μg/kg 添加水平 Spiked level 1 μg/kg 添加水平 Spiked level 5 μg/kg
    回收率 Recovery (%)相对标准偏差 RSD (%,n=6)回收率 Recovery (%)相对标准偏差 RSD (%,n=6)回收率 Recovery (%)相对标准偏差 RSD (%,n=6)
    ZON猪肉 Pork83.57 86.88.9 89.27
    鱼肉 Fish73.61.9 85.34.2 88.54.9
    猪肝 Liver82.87.2 89.26.1 80.25.7
    β-ZAL猪肉 Pork79.88.9 909.8 79.17.3
    鱼肉 Fish78.47.9 876 78.23.3
    猪肝 Liver91.410.2 934.1 89.45.8
    ZAN猪肉 Pork95.37.2 85.46.2 80.26.1
    鱼肉 Fish82.76.3 86.94.3 82.45.7
    猪肝 Liver86.24.9 92.47.5 88.76
    α-ZΟL猪肉 Pork93.89 946.6 89.38.2
    鱼肉 Fish83.15.3 89.56.5 88.84.1
    猪肝 Liver88.56.1 83.35.7 84.35.9
    α-ZAL猪肉 Pork84.18.7 79.37.9 83.35.9
    鱼肉 Fish81.68.2 97.18.4 83.15
    猪肝 Liver84.57.5 85.94.5 82.17.3
    β-ZΟL猪肉 Pork82.78.8 83.35.8 90.95.8
    鱼肉 Fish93.67.6 87.45 804.8
    猪肝 Liver82.78.8 857.4 89.38.1
    AFB1猪肉 Pork78.56.4 90.37.3 92.38.7
    鱼肉 Fish817 81.53.9 87.46.7
    猪肝 Liver90.34.5 88.66.4 84.65.2
    AFB2猪肉 Pork80.611.2 93.210.5 90.810.6
    鱼肉 Fish838.5 88.35.8 81.45
    猪肝 Liver79.24.4 848.2 80.68.1
    AFG1猪肉 Pork81.54.4 80.15.3 94.84.3
    鱼肉 Fish82.46.6 85.64.4 75.63.3
    猪肝 Liver82.26.3 96.73.1 85.92.5
    AFG2猪肉 Pork81.59.7 79.86 87.36.7
    鱼肉 Fish78.76.4 83.95.3 97.88
    猪肝 Liver88.72.9 85.88.2 82.88.3
    AFM1猪肉 Pork816.7 86.44.4 78.54.3
    鱼肉 Fish85.16.3 80.96.9 81.15.5
    猪肝 Liver85.96.4 82.45.6 83.29
    AFM2猪肉 Pork93.77.1 98.47.1 87.86.1
    鱼肉 Fish87.55.2 96.79.1 85.35.2
    猪肝 Liver83.13.1 84.56.2 83.74.3

    3.3.1.   线性方程、检出限及定量限

    分别配制6种玉米赤霉醇类真菌毒素(0.05,0.1,0.5,1.0,5.0,10.0和20.0 μg/L)和6种黄曲霉毒素类真菌毒素(AFB1,AFG1,AFM1和AFM2为0.05,0.1,0.5,1.0,5.0,10.0和20.0 μg/L;AFB2和AFG2为0.03,0.15,0.3,1.5,3.0和6.0 μg/L)系列混合标准溶液。在最优条件下测定,以峰面积为纵坐标(y),标准溶液的质量浓度(μg/L) 为横坐标(x),得到线性回归方程,相关系数均大于0.999,表明各真菌毒素在其线性范围内呈良好的线性关系(见表 3)。采用标准添加法进行测定,以定量离子信噪比(S/N≥3)计算方法的检出限为0.01~0.03 μg/kg;以信噪比(S/N≥10) 计算方法的定量限为0.04~0.09 μg/kg。

    表 3

    表 3  ZER和AFs的线性方程、相关系数、检出限、定量限
    Table 3.  Linear equations,correlation coefficients,limits of determination,limits of quantification for ZER and AFs
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    分析物 Analyte线性范围 Linear range (μg/L)标准曲线 Linear equation相关系数 Correlation coefficient (R2)检出限 LOD (μg/kg)定量限 LOQ (μg/kg)
    ZON0.05~20y=11541x+684.520.99950.020.05
    β-ZAL0.05~20y=15155x-1533.20.99970.020.08
    ZAN0.05~20y＝15662x+ 357.630.99990.020.08
    α-ZOL0.05~20y＝6951.8x+565.850.99980.030.09
    α-ZAL0.05~20y＝15748x-2059.60.99940.030.08
    β-ZOL0.05~20y＝6231.5x-211.860.99960.030.09
    AFB10.05~20y=7303x-602.930.99980.020.07
    AFB20.03~6y=6991.9x+242.710.99960.010.04
    AFG10.05~20y＝2968x-428.590.99950.020.06
    AFG20.03~6y=721.26x-58.850.99930.010.04
    AFM10.05~20y=2699.5x-242.980.99940.020.08
    AFM20.05~20y=2126.2x-108.580.99930.020.08

    4.   结 论

    本研究建立了一种具有高灵敏度和准确性的同时测定6种黄曲霉毒素和6种玉米赤霉醇类真菌毒素HPLC-MS/MS定量分析方法。本方法操作简单,样品前处理特异性好,分析时间短,可用于动物源食品中6种黄曲霉毒素和6种玉米赤霉醇类真菌毒素的检测,为食品安全提供了技术保障。

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  • Figure 1  Extraction recoveries of ZER and AFs in matrices with different solvents

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    Figure 2  Chromatograms of blank sample(left)and positive sample (right)

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    Table 1.  Liquid chromatography (LC) and mass spectrometry (MS) conditions for analaysis of target compounds

    电离模式 Ionization mode
    ESI+modeESI~ mode
    色谱条件 LC condition色谱柱 ColumnShimadzu Shim-pack VP-ODS(150 mm×2.0 mm,5 μm)
    流动相 Mobile phaseA: 乙腈acetonitrile B: 2 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.2%甲酸)2 mmol/L ammonium acetate containing 0.2% formic acid
    进样体积 Injection volume10 μL10 μL
    梯度洗脱程序 Gradient listTime(min) 0 2 7 9 9.5 10 A(%) 10 10 90 90 10 10 B(%) 90 90 10 10 90 90Time(min) 0 7 7.5 8 A(%) 70 70 25 25 B(%) 30 30 75 75
    质谱条件 MS Condition电喷雾压力 Electrospray voltage(IS)5500 V-4500 V
    雾化器压力 Atomization gas pressure (GS1)482 kPa241 kPa
    气帘气压力 Air curtain gas pressure (CUR)207 kPa276 kPa
    辅助气压力 Auxiliary air pressure(GS2)414 kPa414 kPa
    入口电压 Collision chamber inlet voltage(EP)4.5 V-4.5V
    离子源温度 Temperature600℃550℃
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    Table 2.  ESI-MRM conditions for determination of zeranols (ZER) and aflatoxins (AFs)

    分析物 Analyte母离子 Parent ion (m/z)子离子 Daughter ions (m/z)碰撞电压 Collision potential (V)去簇电压 Declustering potential (V)入口电压 Entrance potential (V)出口电压 Collision cell cxit potential (V)
    ZON317.2175.0*,273.0-35,-28-80-8-15,-8
    β-ZAL321.2277.2*,303.2-31,-29-83-10-6,-17
    ZAN319.1275.0*,301.0-31,-35-80-8-15,-15
    α-ZOL319.2275.0*,301.0-31,-31-81-8-19,-19
    α-ZAL321.2277.2*,303.2-31,-29-83-10-6,-17
    β-ZOL319.2275.0*,301.0-31,-31-81-8-19,-19
    AFB1313.2241.1*,285.351,35781122,25
    AFB2315.2259.1*,287.140,36771214,16
    AFG1329.1243.3*,283.236,35901114,14
    AFG2331.1217.3*,245.349,40601412,14
    AFM1329.1273.1*,259.233,35641215,16
    AFM2331.1273.1*,285.133,526311,1018,12
    "*" 定量离子对(Quantitative ion pair) 。ZON: Zearalenone; ZAL: Zeranol; ZAN: Zearalanone; ZOL: Zearalenol; AF6: Aflatoxins.
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    Table 3.  Linear equations,correlation coefficients,limits of determination,limits of quantification for ZER and AFs

    分析物 Analyte线性范围 Linear range (μg/L)标准曲线 Linear equation相关系数 Correlation coefficient (R2)检出限 LOD (μg/kg)定量限 LOQ (μg/kg)
    ZON0.05~20y=11541x+684.520.99950.020.05
    β-ZAL0.05~20y=15155x-1533.20.99970.020.08
    ZAN0.05~20y＝15662x+ 357.630.99990.020.08
    α-ZOL0.05~20y＝6951.8x+565.850.99980.030.09
    α-ZAL0.05~20y＝15748x-2059.60.99940.030.08
    β-ZOL0.05~20y＝6231.5x-211.860.99960.030.09
    AFB10.05~20y=7303x-602.930.99980.020.07
    AFB20.03~6y=6991.9x+242.710.99960.010.04
    AFG10.05~20y＝2968x-428.590.99950.020.06
    AFG20.03~6y=721.26x-58.850.99930.010.04
    AFM10.05~20y=2699.5x-242.980.99940.020.08
    AFM20.05~20y=2126.2x-108.580.99930.020.08
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    Table 4.  Recovery and precisions for ZER and AFs in pork,fish,swine liver (n=6)

    分析物 Analyte基质 Matrix添加水平 Spiked level 0.5 μg/kg 添加水平 Spiked level 1 μg/kg 添加水平 Spiked level 5 μg/kg
    回收率 Recovery (%)相对标准偏差 RSD (%,n=6)回收率 Recovery (%)相对标准偏差 RSD (%,n=6)回收率 Recovery (%)相对标准偏差 RSD (%,n=6)
    ZON猪肉 Pork83.57 86.88.9 89.27
    鱼肉 Fish73.61.9 85.34.2 88.54.9
    猪肝 Liver82.87.2 89.26.1 80.25.7
    β-ZAL猪肉 Pork79.88.9 909.8 79.17.3
    鱼肉 Fish78.47.9 876 78.23.3
    猪肝 Liver91.410.2 934.1 89.45.8
    ZAN猪肉 Pork95.37.2 85.46.2 80.26.1
    鱼肉 Fish82.76.3 86.94.3 82.45.7
    猪肝 Liver86.24.9 92.47.5 88.76
    α-ZΟL猪肉 Pork93.89 946.6 89.38.2
    鱼肉 Fish83.15.3 89.56.5 88.84.1
    猪肝 Liver88.56.1 83.35.7 84.35.9
    α-ZAL猪肉 Pork84.18.7 79.37.9 83.35.9
    鱼肉 Fish81.68.2 97.18.4 83.15
    猪肝 Liver84.57.5 85.94.5 82.17.3
    β-ZΟL猪肉 Pork82.78.8 83.35.8 90.95.8
    鱼肉 Fish93.67.6 87.45 804.8
    猪肝 Liver82.78.8 857.4 89.38.1
    AFB1猪肉 Pork78.56.4 90.37.3 92.38.7
    鱼肉 Fish817 81.53.9 87.46.7
    猪肝 Liver90.34.5 88.66.4 84.65.2
    AFB2猪肉 Pork80.611.2 93.210.5 90.810.6
    鱼肉 Fish838.5 88.35.8 81.45
    猪肝 Liver79.24.4 848.2 80.68.1
    AFG1猪肉 Pork81.54.4 80.15.3 94.84.3
    鱼肉 Fish82.46.6 85.64.4 75.63.3
    猪肝 Liver82.26.3 96.73.1 85.92.5
    AFG2猪肉 Pork81.59.7 79.86 87.36.7
    鱼肉 Fish78.76.4 83.95.3 97.88
    猪肝 Liver88.72.9 85.88.2 82.88.3
    AFM1猪肉 Pork816.7 86.44.4 78.54.3
    鱼肉 Fish85.16.3 80.96.9 81.15.5
    猪肝 Liver85.96.4 82.45.6 83.29
    AFM2猪肉 Pork93.77.1 98.47.1 87.86.1
    鱼肉 Fish87.55.2 96.79.1 85.35.2
    猪肝 Liver83.13.1 84.56.2 83.74.3
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  • 收稿日期:  2015-07-22
  • 修回日期:  2016-04-12
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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