α-乙酰胺基-β-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙烯酸(5)的制备：向装有冷凝器的250 mL三口瓶中，依次加入20 mL醋酐、3,4-二羟基苯甲醛(5.55 g，0.04 mol)、醋酸钠(4.92 g，0.06 mol)，N-乙酰甘氨酸(5.68 g，0.048 mol)，开启磁力搅拌器，升温至100 ℃恒温反应，TLC检测反应进程(V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=3∶2)。 随着反应进行，溶液由澄清的淡黄色逐渐变成褐色。 3 h后反应结束、冷却至室温，有褐色固体析出。 将反应混合物倾入200 mL冰水混合物中搅拌开环，析出大量黄色晶体，置冰箱中冷藏过夜，减压抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤得粗品，粗品沸水重结晶并真空干燥得到化合物4，为黄色结晶粉末，10.29 g，产率84.8%，mp 187～189 ℃(文献值^[15]：186～189 ℃)，MS(m/z)：322.1(M+H)。 IR(KBr)，σ/cm^-1:3424，3270，2400～3000，1778、1692，1640，1540、1507、1432、1373、860、838；¹³C NMR(500 MHz，DMSO-d₆)，δ：169.8，168.8，167.9，166.7，144.3，144.2，133.7，132.9，131.1，129.6，128.4，125.0，23.0，20.8，15.9；¹H NMR(400 MHz，CDCl₃)，δ：8.06(d,J=4 Hz，ArH，1H)，7.88(dd,J=2,8 Hz，ArH，1H)，7.27(d,J=8 Hz，ArH，1H)，7.06(s，1H)，2.40(s，3H)，2.32(s，3H)，2.31(s，3H)。

β-(3,4-二羟基苯基)丙酮酸(6)的制备：向装有冷凝器的250 mL三口瓶中，加入1 mol/L盐酸溶液75 mL和α-乙酰胺基-β-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙烯酸(4.82 g，0.015 mol)，回流反应10 h，反应液冷却至室温后用乙酸乙酯萃取(50 mL×3)，有机相减压蒸馏去除溶剂，残液凝固并干燥后得类白色粉末2.62 g，产率89.0%，mp 189～193 ℃(文献值^[11]：192～196 ℃)，MS(m/z)：195.1(M—H)。 IR(KBr)，σ/cm^-1：3388、3242，2400～3000，1691，1655，1521、1443、1384、860、814；¹³C NMR(500 MHz，DMSO-d₆)，δ：167.1，145.7，145.3，139.6，126.7，122.2，115.8，111.3；¹H NMR(400 MHz，DMSO-d₆)，δ：12.92(s，1H，COOH)，9.02(s，1H，ArOH)，8.94(s，1H，ArOH)，8.74(s，1H，—OH)，7.35(d,J=4 Hz，1H)，6.94(dd,J=2.0,8.4 Hz，1H，ArH)，6.68(d,J=8.4 Hz，1H，ArH)，6.26(s，1H)。

丹参素(1)的制备：向50 mL pH=6.0的磷酸盐缓冲液中加入β-(3,4-二羟基苯基)丙酮酸(0.125 g，6.35 mmol)、辅助底物葡萄糖1.00 g和36 h菌龄的静息细胞1.25 g，于30 ℃下120 r/min振荡反应24 h后，发酵液经离心除去菌体，取上清液微滤后经高效液相色谱制备目标产物丹参素0.116 g，收率92.0%，比旋光度=15.6(c 0.025,CH₃OH)(文献值^[28][α]_D=16(c 0.1,CH₃OH))，对映体过量ee值为97.5%。 经液相色谱检测^[29]R-丹参素出峰时间为6.3 min，S-丹参素出峰时间为6.8 min。 液相色谱分析测条件：Kromstar^TM-C8(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为甲醇溶液(含8 mmol/L L-苯丙氨酸和3 mmol/L硫酸铜，采用NaOH调pH=3.5)(体积比18∶82)，柱温20 ℃，检测波长λ=279 nm，v=1.0 mL/min。 IR(KBr)，σ/cm^-1:3309，2400~3000，1726，1607、1519、1445、860、811；¹³C NMR(400 MHz，DMSO-d₆)，δ：175.28、144.73、143.62、128.80、120.80、116.88、115.20、71.49、40.13；¹H NMR(400 MHz，D₂O)，δ：6.91～6.75(m，2H，ArH)，6.71(d,J=8 Hz，1H，ArH)，4.18(dd,J=4,8 Hz，1H)，2.95(dd,J=4,20 Hz，1H)，2.74(dd,J=7,13 Hz，1H)。

2 结果与讨论

2.1 盐酸用量对化合物6产率的影响

在水解反应制备β-(3,4-二羟基苯基)丙酮酸过程中，发现盐酸用量对其产率的影响较大，结果如表 1所示。 由表 1可知，随HCl (c=1 mol/L)用量增加，目标产物产率先增加后降低，当盐酸用量为75 mL时，即HCl与原料摩尔比大约为5∶1时，产率达到最大值83.0%。 原因可能是HCl用量的增多有利于原料的水解，但HCl用量增加到一定程度后，目标产物可能发生脱羧副反应，导致产率下降。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 盐酸用量对化合物6产率的影响 Table 1 Effect of hydrochloric acid dosage on compound 6 yield V(HCl)/mL 45 75 120 150 225 300 Danshensu yield/% 65.6 83.0 80.4 78.2 70.7 70.1

表 1 盐酸用量对化合物6产率的影响 Table 1 Effect of hydrochloric acid dosage on compound 6 yield

2.2 酶催化剂的选择

为确定生物还原合成丹参素的酶催化剂，采用微生物发酵法对燕子牌酵母、梅山牌酵母、彩虹牌酵母及乳酸片球菌ATCC1.2696菌种进行了筛选，发现只有乳酸片球菌ATCC1.2696菌株能有效催化羰基不对称还原，结果如图 1所示。 由图 1可知，R-丹参素的出峰时间为6.3 min，在乳酸片球菌ATCC1.2696发酵液中检测到该信号峰，与R-丹参素标准样品一致，由此可证明，乳酸片球菌ATCC1.2696菌株能确实有效地催化3,4-二羟基苯基丙酮酸不对称还原合成丹参素。

图 1

Fig. 1

图 1 R-丹参素标准品(A)和发酵液(B)的高效液相图谱 Fig. 1 The HPLC curves of standard sample and fermented liquidwithresting cells

2.3 葡萄糖浓度对静息细胞转化的影响

为了简化生物转化过程，我们采用乳酸片球菌静息细胞转化进行3,4-二羟基苯基丙酮酸的生物催化还原。 静息细胞转化法能简化培养基组成，便于产物的分离纯化，不需无菌条件，易于操作，还可重复多次利用^[30]。 完整的静息细胞可在其代谢过程中产生与催化过程相匹配的辅酶，使催化反应得以顺利进行。 许多全细胞催化剂都具有内在的辅酶再生途径，即可通过加入辅助底物(如葡萄糖、异丙醇等)的方式实现辅酶的原位再生^[31]，本文以葡萄糖作为辅助底物以激活辅酶的再生^[32]。 由于静息细胞转化过程中需考察的影响因素较多，比如菌龄、反应时间、细胞浓度、葡萄糖浓度、底物浓度、反应温度和pH值等，本文以辅助底物葡萄糖浓度为例，讨论其对丹参素转化效率的影响，并以10 mL pH=6.0的磷酸盐缓冲液配制β-(3,4-二羟基苯基)丙酮酸浓度1 g/L、pH=6.0、培养36 h的菌体浓度25 g/L的反应液于30 ℃下反应24 h，考察不同葡萄糖浓度对丹参素转化的影响，结果如表 2所示。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 葡萄糖浓度对生物还原合成丹参素的影响 Table 2 Effect of glucose concentration on Danshensu yield by resting cells ρ(glucosecon)/(g·L-1) 0 5 10 15 20 25 Danshensu yield/% 16.0 47.8 67.3 70.5 73.0 48.6

表 2 葡萄糖浓度对生物还原合成丹参素的影响 Table 2 Effect of glucose concentration on Danshensu yield by resting cells

由表 2可知，在不添加葡萄糖的时候，丹参素的产率处于较低水平，随着葡萄糖浓度的增加，丹参素的产率大幅度增加，这说明葡萄糖确实激活了乳酸片球菌1.2696菌株的辅酶再生途径；当葡萄糖浓度达到20 g/L时，丹参素产率达到最大值，进一步增加葡萄糖浓度，丹参素产率反而有所下降，说明辅酶过量也会抑制催化反应的进行。

3 结 论

本文以3,4-二羟基苯甲醛和乙酰甘氨酸为原料，经Erlenmeyer合成反应后直接开环得到α-乙酰氨基-β-(3,4-二乙酰氧基苯基)丙烯酸、盐酸水解制得β-(3,4-二羟基苯基)丙酮酸。 利用生物催化具有良好的区域选择性和对映选择性，采用乳酸片球菌静息细胞生物酶催化还原合成了天然右旋丹参素。 该方法原料价廉易得，反应条件温和，操作简便，丹参素产率高。

参考文献

32

[1]	Chang J Y, Chang C Y, Kuo C C, et al. Salvinal,a Novel Microtubule Inhibitor Isolated from Salvia Miltiorrhizae Bunge (Danshen),with Antimitotic Activity in Multidrug-sensitive and Resistant Human Tumor Cells[J]. Mol Pharmacol , 2004, 65 (1) : 77–84. DOI:10.1124/mol.65.1.77 ()
[2]	Husna B, On T, Zhu Y Z. Effects of Purified Salvia Miltiorrhiza Extract on Cardiac Vascular Smooth Muscle Hypoxic Cells[J]. J Pharmacol Sci , 2007, 104 (3) : 202–211. DOI:10.1254/jphs.FP0061344 ()
[3]	Vergara-Salinas J R, Pérez-Jiménez J, Torres J L, et al. Effects of Temperature and Time on Polyphenolic Content and Antioxidant Activity in the Pressurized Hot Water Extraction of Deodorised Thyme (Thymus Vulgaris)[J]. J Agric Food Chem , 2012, 60 (44) : 10920–10929. DOI:10.1021/jf3027759 ()
[4]	Wang M, Sun G B, Sun X, et al. Cardioprotective Effect of Salvianolic Acid B Against Arsenic Trioxide-induced Injury in Cardiac H9c2 Cells via the PI3K/Akt Signal Pathway[J]. Toxicol Lett , 2013, 216 (2/3) : 100–107. ()
[5]	Ding M, Ye T X, Zhao G R, et al. Aqueous Extract of Salvia Miltiorrhiza Attenuates Increased Endothelial Permeability Induced by Tumor Necrosis Factor-Alpha[J]. Int Immunopharmacol , 2005, 5 (11) : 1641–1651. DOI:10.1016/j.intimp.2005.05.005 ()
[6]	HU Fengguo, DENG Yongjian. The Search of Danshen Water-soluble Compositionses Makes Progress[J]. Primary J Chinese Mater Med , 2014, 3 (7) : 176–178. (in Chinese) 胡凤国, 邓永建. 丹参水溶性成分的研究进展[J]. 基层中药杂志 , 2014, 3 (7) : 176–178. ()
[7]	DING Jie, YU Zemin, DING Keyi. Synthesis of Danshensu[J]. J Southwest Univ Nat(Nat Sci Ed) , 2015, 41 (1) : 50–53. (in Chinese) 丁杰, 余泽民, 丁克毅. 丹参素的合成工艺研究[J]. 西南民族大学学报:自然科学版 , 2015, 41 (1) : 50–53. ()
[8]	DENG Xiling, CHEN Xuemin, JIANG Fashou, et al. Synthesis of Sodium β-(3,4-Dihydroxyphenyl) lactate[J]. Chinese J Pharm , 2005, 9 (9) : 523–524. (in Chinese) 邓喜玲, 陈学敏, 江发寿, 等. 丹参素的合成[J]. 中国医药工业杂志 , 2005, 9 (9) : 523–524. ()
[9]	Chen M, Chen H, Wang Y, et al. Efficient and Practical Asymmetric Synthesis of Isopropyl (R)-3-(3',4'-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoate and Its Enantiomer[J]. Tetrahedron:Asymmetry , 2011, 22 (1) : 4–7. DOI:10.1016/j.tetasy.2010.11.030 ()
[10]	XUE Fen, DAI Huajuan, DING Lirong. Synthesis of Sodium β-3,4-Dihydroxyphenyl Lactate"Danshensu"[J]. Acta Acad Med Primae Shanghai , 1983, 10 (2) : 133–135. (in Chinese) 薛芬, 戴华娟, 丁丽蓉. 丹参素[β-(3,4-二羟基苯基)乳酸钠]的合成[J]. 上海第一医学院学报 , 1983, 10 (2) : 133–135. ()
[11]	Wong H N C, Xu Z L, Chang H M, et al. A Modified Synthesis of (±)-β-Aryllactic Acids[J]. Synthesis , 1992, 1992 (8) : 793–797. DOI:10.1055/s-1992-26228 ()
[12]	Eicher T, Ott M, Speicher A. Bryophyte Constituents;7:New Synthesis of (+)-Rosmarinic Acid and Related Compounds[J]. Synthesis , 1996, 1996 (6) : 755–762. DOI:10.1055/s-1996-4289 ()
[13]	Bubl E C, Butts J S. A Method of Synthesis of Phenyllactic Acid and Substituted Phenyllactic Acids[J]. J Am Chem Soc , 1951, 73 (10) : 4972–4972. ()
[14]	LI Xiaoling, SHAN Yuqing, ZHANG Qunzheng, et al. Synthetic Methods of Danshensu and Its Derivatives[J]. Chinese J Pharm , 2008, 17 (10) : 17–19. (in Chinese) 李小玲, 单玉庆, 张群正, 等. 丹参素及其衍生物的合成方法[J]. 中国药业 , 2008, 17 (10) : 17–19. ()
[15]	Dong C, Wang Y, Zhu Y Z. Asymmetric Synthesis and Biological Evaluation of Danshensu Derivatives as Anti-Myocardial Ischemia Drug Candidates[J]. Bioorg Med Chem , 2009, 17 (9) : 3499–3507. DOI:10.1016/j.bmc.2009.02.065 ()
[16]	TONG Yuanfeng, GUO Xiaoyun, CHENG Yonghao, et al. Synthesis of dl-tanshinol[J]. Chinese J Med Chem , 2007, 17 (2) : 92–94. (in Chinese) 童元峰, 郭晓赟, 程永浩, 等. Dl-丹参素的合成[J]. 中国药物化学杂志 , 2007, 17 (2) : 92–94. ()
[17]	ZHANG Qunzheng, DONG Yan, NAN Yefei, et al. Synthesis of β-(3,4-Dihydroxyphenyl)-α-hydroxy Propionic Acid Esters[J]. Chinese J Org Chem , 2009, 29 (9) : 1466–1469. (in Chinese) 张群正, 董岩, 南叶飞, 等. β-(3,4-二羟基苯基)-α-羟基丙酸异丙酯/冰片酯合成研究[J]. 有机化学 , 2009, 29 (9) : 1466–1469. ()
[18]	SUN Ju, GU Jun, LI Lingzhi. Synthesis of Danshensu Derivatives[J]. Chinese J Synth Chem , 2010, 18 (2) : 215–218. (in Chinese) 孙举, 顾军, 李灵芝. 丹参素衍生物的合成[J]. 合成化学 , 2010, 18 (2) : 215–218. ()
[19]	Bai Y, Zhang Q, Jia P, et al. Improved Process for Pilot-Scale Synthesis of Danshensu ((±)-DSS) and Its Enantiomer Derivatives[J]. Org Process Res Dev , 2014, 18 (12) : 1667–1673. DOI:10.1021/op4002593 ()
[20]	LIU Pei, QIN Fanggang, BAI Yajun, et al. Synthesis and Chiral Separation of Isopropyl and Bornyl β-(3,4-Dihydroxyphenyl)-α-Hydroxypropionate[J]. J Northwest Univ , 2015, 45 (3) : 413–417. (in Chinese) 刘佩, 秦方刚, 白亚军, 等. 丹参素异丙酯/冰片酯的合成及手性拆分研究[J]. 西北大学学报 , 2015, 45 (3) : 413–417. ()
[21]	ZHOU Xiaoming, XUE Fen, LOU Yaping, et al. Asymmetric Synthesis of Optically Active β-Phenyl Latic Acid and Its Methyl Ester[J]. Acta Acad Med Primae Shanghai , 1988, 15 (2) : 155–160. (in Chinese) 周小鸣, 薛芬, 楼亚平, 等. 用不对称环氧化合成光学活性β-苯基乳酸及其甲酯[J]. 上海第一医学院学报 , 1988, 15 (2) : 155–160. ()
[22]	JIANG Ru,CHEN Hui,LIU Xueying,et al.Asymmetric Synthesis of (+)-Danshensu[P],CN 102924265A,2013-02-13(in Chinese). 姜茹,陈惠,刘雪英,等.(+)-丹参素的不对称合成方法[P],CN 102924265A,2013-02-13. ()
[23]	TIAN Hailin, ZHOU Xiaowei, CHEN Ming, et al. Asymmetric Synthesis of Danshensuborneol Ester[J]. Chinese J Med Chem , 2012, 22 (2) : 113–116. (in Chinese) 田海林, 周晓伟, 陈明, 等. 丹参素冰片酯不对称合成研究[J]. 中国药物化学杂志 , 2012, 22 (2) : 113–116. ()
[24]	Simon R C, Mutti F G, Kroutil W. Biocatalytic Synthesis of Enantiopure Building Blocks for Pharmaceuticals[J]. Drug Discovery Today:Technol , 2013, 10 (1) : 37–44. DOI:10.1016/j.ddtec.2012.08.002 ()
[25]	Patel R N. Synthesis of Chiral Pharmaceutical Intermediates by Biocatalysis[J]. Coord Chem Rev , 2008, 252 (5) : 659–701. ()
[26]	Wang H, Zong M H, Wu H, et al. Novel and Highly Regioselective Route for Synthesis of 5-Fluorouridine Lipophilic Ester Derivatives by Lipozyme TLIM[J]. J Biotechnol , 2007, 129 (4) : 689–695. DOI:10.1016/j.jbiotec.2007.02.008 ()
[27]	ZHAO Shuling, GU Yaohua, XUE Ping. Recent Progress on Chemo-enzymatic Synthesis of Chiral Compounds with High Stereoselectivity[J]. Chem Res Appl , 2014, 26 (4) : 473–382. (in Chinese) 赵淑玲, 谷耀华, 薛屏. 化学-酶法高选择性合成手性化合物的研究进展[J]. 化学研究与应用 , 2014, 26 (4) : 473–382. ()
[28]	Güvenalp Z, Str ch K, Demirezer L, et al. Phytochemical and Antimicrobial Investigation of Echium Vulgare Growing in Turkey[J]. Biochem Syst Ecol , 2004, 32 (9) : 833–836. DOI:10.1016/j.bse.2003.12.001 ()
[29]	XIE Fei, ZHOU Xinbo, GUO Jiqian, et al. Chiral Separation of Danshensu en Antiomers by HPLC[J]. Chinese J Pharm Anal , 2014 (4) : 664–668. (in Chinese) 谢菲, 周辛波, 郭继倩, 等. 高效液相色谱法手性拆分丹参素对映体的研究[J]. 药物分析杂志 , 2014 (4) : 664–668. ()
[30]	Wang Z, Chen Z D, Li D. Biotransformation of Phytosterol to Produce Androsta-Diene-Dione by Resting Cells of Mycobacterium in Cloud Point System[J]. Process Biochem , 2006, 41 (3) : 557–561. DOI:10.1016/j.procbio.2005.09.014 ()
[31]	Goldberg K, Schroer K, Lütz S, et al. Biocatalytic Ketone Reduction-A Powerful Tool for the Production of Chiral Alcohols-Part Ⅱ:Whole-Cell Reductions[J]. Appl Microbiol Biotechnol , 2007, 76 (2) : 249–255. DOI:10.1007/s00253-007-1005-x ()
[32]	HUANG He, YANG Zhonghua, YAO Shanjing. Asymmetric Reduction Carboonyl Compounds to Chrial Alcohols by Baker's Yeast[J]. Chinese J Bioprocess Eng , 2004, 2 (2) : 52–55. (in Chinese) 黄和, 杨忠华, 姚善泾. 面包酵母催化羰基不对称还原合成手性醇的研究[J]. 生物加工过程 , 2004, 2 (2) : 52–55. ()

X