5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺-铜配合物的合成及其抗菌活性

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	Received: 2015-08-19

	Revised: 2015-11-13

	Accepted: 2016-01-05


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	文丽君

	王英

	李海霞

	李娟

文丽君^a, 王英^b, 李海霞^a, 李娟^a

^a 海南医学院药学院海口 571199;
^b 海南医学院热带医学与检验医学院海口 571199

2015-08-19收稿, 2015-11-13修订, 2016-01-05接受

基金项目: 海南医学院科研培育基金项目（HY2013-23）；海南省自然科学基金项目（20152040）

通讯联系人: 李海霞,副教授;Tel:0898-66972095;E-mail:782430794@qq.com;研究方向:配合物药物

摘要: 以2，3-二甲基-5，6-二氰基吡嗪为原料，稀碱条件下不完全氧化得到配体5，6-二甲基-2，3-吡嗪二甲酰胺，再与醋酸铜在弱碱条件下合成5，6-二甲基-2，3-吡嗪二甲酰胺-铜配合物；采用牛津杯法预试验及试管二倍稀释法研究配体5，6-二甲基-2，3-吡嗪二甲酰胺及其配合物的抗菌活性。对合成的配合物通过紫外光谱、红外光谱、差热-热重分析进行确证表征。该配合物表现出较好的抑菌和杀菌作用，对大肠埃希菌的MIC和MBC均为50 mg/L，对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC均为25 mg/L，而配体没有明显的抑菌杀菌作用，从而为临床疾病的治疗和食品添加剂的研发提供参考。

关键词: 二甲基-吡嗪二甲酰胺铜配合物合成抗菌活性

Synthesis and Antibacterial Activity of 5,6-Dimethyl-2,3-pyrazinedimethylformamide-Cu

WEN Lijun^a, WANG Ying^b, LI Haixia^a, LI Juan^a

^a College of Pharmacy, Hainan Medical College, Haikou 571199, China;
^b Tropical and Laboratory Medicine School, Hainan Medical College, Haikou 571199, China

Received: 2015-08-19; Revised: 2015-11-13; Accepted: 2016-01-05

Abstract: 5,6-Dimethyl-2,3-pyrazinedimethylformamide-Cu was prepared from Cu(CH₃COO)₂ and 5,6-dimethyl-2,3-pyrazinedimethylformamide which was synthesized via hydrolysis of 5,6-dimethyl-2,3-pyrazinecarbonitrile in the dilute basic solution using H₂O₂ as the oxidant. The antibacterial activity of 5,6-dimethyl-2,3- pyrazinedimethylformamide and the complex were compared by the Oxford cup method and tube double dilution method. The complex was characterized by UV and IR spectroscopies and TGA. The 5,6-dimethyl-2,3-pyrazinedimethylformamide-Cu shows good bacteriostatic and bactericidal effects. Both the minimum antimicrobial and the germicidal dosages against E.coli and Staphylococcus aureus are 50 mg/L and 25 mg/L, respectively, while 5,6-dimethyl-2,3-pyrazinedimethylformamide does not show obvious inhibitory effect, providing a reference for the clinical treatment of diseases and the development of food additives.

Key words: dimethyl-pyrazinedimethylformamide copper complex synthesis antibacterial activity

5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺属吡嗪类化合物。吡嗪类化合物在药物上主要起抗结核、驱饶虫、抗惊厥、杀菌、清除自由基等重要的药理活性作用^[1]，并在香料、食品工业中也有着重要用途^[2-3]。吡嗪杂环中的氮原子和酰胺基中的氮、氧原子均有孤对电子，可提供电子与中心金属离子形成配位键，从而为金属离子的配位提供多原子配位点。同时由于酰胺基是很好的氢键前体，两个酰胺中的氮原子都可能参与配位，增强了N—H键的极性，有利于氢键的形成，使药物分子更易与受体作用从而增强药物分子的药效^[4]。因此，5，6-二甲基-2，3-吡嗪二甲酰胺是一个良好的配体，其金属配合物可能具有良好的生物活性。铜是人体必需微量元素,是机体中许多金属酶的辅助因子，也是免疫反应中必需的金属元素，能增强机体的防御机能。本文以合成的5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺为配体，在弱碱条件下与醋酸铜反应制备5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺-铜配合物，并研究该配合物对临床常见的大肠埃希菌、白假丝酵母菌及金黄色葡萄球菌的抗菌活性，从而为其它药物和食品添加剂的研制开发提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器、SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限公司)；JASCO-FI-4100型傅里叶红外光谱仪(美国Perkin-elmer公司)；UV100P型紫外可见分光光度计(上海凤凰光学科仪有限公司)；DZF-6021型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；全自动高压蒸气灭菌器(美国致微(厦门)仪器公司)；生化培养箱(上海博迅仪器有限公司)。

2，3-二甲基-5，6-二氰基吡嗪(99%，美国Aldrich公司)；丙酮、NaOH、30%H₂O₂、甲醇、一水合乙酸铜(Cu(CH₃COO)₂·H₂O)、无水乙醇均购于广州化学试剂厂，分析纯；水解酪蛋白(Mueller-Hinton,MH)琼脂培养基、MH液体培养基、沙氏琼脂培养基、沙氏液体培养基(杭州天和微生物试剂有限公司)。

1.2 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的合成

参考文献^[5]将0.316 g(0.002 moL)2，3-二甲基-5，6-二氰基吡嗪加到三颈烧瓶中，再加入32 mL质量分数为5%的NaOH水溶液和32 mL丙酮,电磁搅拌；滴加14 mL质量分数为10%的H₂O₂溶液至三颈烧瓶，于15 min内滴加完毕，升温至50 ℃，继续搅拌反应约6 h。反应液由棕褐色变为棕黄色、黄色、透明浅黄，最后又逐渐加深至棕褐色，停止反应，减压浓缩，剩余物用甲醇洗涤，析出沉淀，抽滤，烘干，得黄色粉末状固体^[5]。

1.3 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺-铜配合物的合成

称取0.1476 g 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺加到100 mL无水乙醇中，超声溶解，得黄色溶液,pH值约为7,置于三颈烧瓶中；将0.2267 g乙酸铜·一水超声溶解于10 mL无水乙醇中，得浅蓝色透明溶液,置于恒压滴液漏斗，将该溶液缓慢滴加到搅拌中的三颈烧瓶中(20 min内滴加完)，升温至40 ℃搅拌反应约10 h，溶液颜色从黄色经浅绿色变为绿色，停止反应，静置，析出绿色沉淀，离心，洗涤，烘干，得绿色固体，微溶于水。

1.4 抑菌活性测试

1.4.1 牛津杯法

先用牛津杯法^[6]预试配体5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺及其铜配合物的抑菌活性，观察并记录抑菌圈大小。

1.4.2 试管二倍稀释法

牛津杯法预试有抑菌效果的药液，其最低抑菌浓度(MIC)采用试管二倍稀释法进行测定。参照文献^[6]的操作,以肉眼观察无菌生长的试管中所含药物的最低浓度即为最低抑菌浓度，重复3次。将未见细菌或真菌生长管，参照文献^[6]的操作，测定其最低杀菌浓度(MBC)。

2 结果与讨论

2.1 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺-铜配合物的表征

2.1.1 紫外光谱

以水为溶剂，由图 1A可知，5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺在284 nm处有最大吸收峰，与铜配位后，最大吸收峰红移8 nm至292 nm处(见图 1B)，说明铜与5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺形成了配合物，5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的结构略有改变。

图 1 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺(A)及其铜配合物(B)的紫外光谱 Fig. 1 UV spectra of 5,6-dimethyl-2,3- pyrazinedimethylformamide(A) and its copper cmoplex(B)

2.1.2 配合物的红外光谱

采用KBr压片法，对5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺铜配合物进行红外光谱扫描，结果如图 2所示。

图 2 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺-铜配合物的红外光谱 Fig. 2 IR Spectrum of 5,6-dimethyl-2,3-pyrazinedimethylformamide-Cu

由图 2可知，相对于配体^[5]，酰胺上N—H键的伸缩振动吸收峰低波数移动18 cm^-1到3424 cm^-1处，说明酰胺中N原子参与配位；—CONH₂的C—N的伸缩振动吸收峰位于1408 cm^-1处，也低波数移动52 cm^-1，进一步说明酰胺中N原子参与配位；组峰1567 cm^-1为吡嗪环的骨架振动及羰基的伸缩振动吸收峰，相对于配体低波数方向移动27 cm^-1，说明吡嗪环的氮原子或羰基氧原子可能发生了配位。吡嗪环的特征吸收峰从1122 cm^-1迁移到了1176 cm^-1，说明吡嗪环的氮原子参与了配位。

2.1.3 热重分析

5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺-铜配合物的热重分析如图 3所示。

图 3 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺-铜配合物的差热热重分析图 Fig. 3 DSC-TGA curves of 5,6-dimethyl-2,3-pyrazinedimethylformamide-Cu

由图 3可知，,配合物在90～110 ℃之间出现第一失重阶段，失重率约为11%，此阶段失重的水为配合物分子外的结晶水，与失去2个水分子的量相当;第二失重阶段在200～330 ℃之间，此时配体迅速燃烧分解，吡嗪环骨架断裂，失重率为45%，与失去1个配体分子相当;最终分解产物是铜的氧化物，约为44%。推测配合物的组成为[Cu₂(C₈N₄H₁₀O₂)]·2H₂O。

2.2 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺-铜的抑菌活性

牛津杯法预试发现：配体对大肠埃希菌、白假丝酵母菌及金黄色葡萄球菌的抑菌圈均＜6，无明显抑菌效果，而其铜配合物对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈为19 mm(＞8 mm)，抑菌效果明显。试管二倍稀释法发现，5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺-铜配合物的抑菌及杀菌情况见表 1和表 2。

表 1 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺-铜配合物的抑菌活性(n=3) Table 1 Antibacterial activity of 5,6-dimethyl-2,3-pyrazinedimethylformamide-Cu(n=3)

表 2 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺-铜配合物的MBC值(n=3) Table 2 The germicidal dosage of 5,6-dimethyl-2,3- pyrazinedimethylformamide-Cu(n=3)

由表 1、表 2可知，5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺-铜配合物对所测大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌有较好的抑菌杀菌作用。其中对大肠埃希菌的MIC和MBC均为50 mg/L，对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC均为25 mg/L。

3 结论

5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺与铜离子配位形成5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺-铜配合物，由紫外光谱、红外光谱及热重分析的结果，可以推断配合物的组成为[Cu₂(C₈N₄H₁₀O₂)]·2H₂O。研究表明^[8]，金属配合物的生物活性与金属中心离子性质有关，有的活性比配体增强，有的甚至产生新的活性作用。本文5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺易溶于水，本身无抗菌活性，但与金属配位后，水溶性降低，产生了新的抗菌作用。如与铜配位后，对大肠埃希菌的MIC和MBC均为50 mg/L，对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC均为25 mg/L，而对白假丝酵母菌无明显抑菌杀菌作用；但在与镍^[6]配位后，对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌无明显抑菌杀菌作用，而对白假丝酵母菌的MIC为50 mg/L，MBC为100 mg/L，这进一步说明金属配合物相对于配体，脂溶性增加，有渗透到微生物膜内部的特性^[7]，可能产生新的生物活性，并且金属配合物的抗菌活性是与金属中心离子的性质有关的。 5,6-二甲基-2,3-吡嗪二甲酰胺的铜配合物对细菌有活性，但对真菌却没有活性，而其镍配合物却对细菌没有活性，而对真菌却有活性，这得从杀菌机理入手，有待进一步研究。

参考文献

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