罗丹明B(Rhodamine B)，又称玫瑰红B，是一种人工合成碱性染料，因其颜色鲜艳且有荧光性，常作为动物细胞荧光染色^[1]，其修饰物探针在生物学方面有作用广泛^[2-3]。 研究显示，罗丹明B具有潜在致癌性、致突变性和心脏毒性，目前已被国际癌症研究署(IARC)列为致癌物质，禁止作为食品染色剂^[4]。2008年，我国卫生部也将其列入第一批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中。但因其廉价易得，色泽红艳、稳定性强等特点，仍有不法商人将其作为苏丹红替代品为花椒、辣椒等食品染色，严重危害消费者身体健康。因此，对罗丹明B的残留检测显得尤为必要。

罗丹明B的检测方法主要有高效液相色谱法^[5-6]、液相色谱-串联质谱法^[7-9]。实际食品检测中一些不科学的前处理，以及提取的样品底物中存在复杂的干扰物质以及基质效应等，均会对分析结果造成较大偏差^[10-11]。 随着质谱技术的发展，同位素稀释质谱法(IDMS)被广泛应用于样品检测。采用同位素化合物作为内标，可有效避免上述基质效应、前处理和检测器等因素的影响，显著提高方法的稳定性和准确性，因此被国际物质量咨询委员会(CCQM)规定为微量、痕量和超痕量元素的唯一权威检测方法^[12-13]。 本文开发了D₄-罗丹明B的合成方法，并将其作为内标用于果汁中罗丹明B的残留检测，与现有行标SN/T 2430-2010相比，其在检测限、回收率和准确性方面显著优于现有方法，可作为内标试剂用于食品安全领域违禁色素的检测。

目前，稳定同位素氘标记罗丹明的合成未见报道。天然丰度罗丹明B一般采用邻苯二甲酸酐法合成^[14]。 本文对此进行了改进，首次以自制的D₄-邻苯二甲酸为同位素标记起始原料，与3-羟基-N,N-二乙基苯胺反应，合成得到稳定同位素标记D₄-罗丹明B。 与常规邻苯二甲酸酐法合成相比，该实验略去了制备D₄-邻苯二甲酸酐的制备步骤，总体合成路线简单可靠，有效避免了稳定同位素丰度的稀释，得到的D₄-罗丹明B具有很高的化学纯度和同位素丰度，是罗丹明B检测用的理想内标试剂，具体合成路线如Scheme 1所示。

Scheme 1

Scheme1

Scheme 1 The synthetic route of D4-rhodamine B

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

ThermoFiningan TSQ/Accela型质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，电喷雾(ESI)离子源，喷雾电压3500 V，全扫描检测模式；LC-20AT型高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)，色谱柱为Athena WP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：V(甲醇)∶V(水)=75∶25溶液，流速为1.0 mL/min，UV检测器，检测波长550 nm；Agilent-NMR-vnmrs600型核磁共振仪(美国安捷伦公司)，溶剂为CDCl₃，频率600 MHz。 D₁₀-邻二甲苯(百灵威，99.0% atom D)，3-羟基-N,N-二乙基苯胺、盐酸、邻二甲苯、氯化钠、氢氧化钾等购自江苏强盛功能化学股份有限公司，均为分析纯试剂。 所有试剂直接使用。

1.2 D₄-罗丹明B的合成

将D₁₀-邻二甲苯(2.32 g，20 mmol)，高锰酸钾(15.80 g，100 mmol)，加入三口烧瓶中，加入50 mL蒸馏水，100 ℃，回流6 h，停止反应，冷却后加入80 mL饱和亚硫酸氢钠溶液，加入氢氧化钾调节pH值至12，过滤，用盐酸(质量浓度36%)滤液调节pH值至2，冷却降温，结晶后抽滤，真空干燥，得白色固体D₄-邻苯二甲酸1.92 g，收率为56.6%(以D₁₀-邻二甲苯计)，氘同位素丰度99.0%。 ESI-MS:169[M-1]^-。

将D₄-邻苯二甲酸(1.70 g，10 mmol)，加入带有温度计的100 mL的三口烧瓶中，再依次加入3-羟基-N,N-二乙基苯胺(2.37 g，14 mmol)，邻二氯苯20 mL，175 ℃，反应3 h。 停止反应，静置待反应物冷却后，用100 mL 0.06 mol/L盐酸溶液溶解，再加入1.5 g氯化钠，静置8 h，结晶后抽滤，真空干燥，再以V(乙酸乙酯)∶V(乙醇)=9∶1重结晶后，得到3.23 g紫红色固体D₄-罗丹明B，收率65.2%，化学纯度98.3%，氘同位素丰度98.4%。 ¹H NMR(600 MHz，CDCl₃),δ:6.56~6.58(d,2H,J=12 Hz),6.44~6.45(d,2H,J=6 Hz),6.32~6.34(dd,2H,J₁=12 Hz,J₂=6 Hz),3.34~3.37(q,8H,J=6 Hz),1.15~1.17 (t,12H,J=6 Hz);ESI-MS:447[M-36]⁺ 。

1.3 D₄-罗丹明B残留检测

取100 mL市场销售的3种A、B、C不同果汁试样，分别加入0.7 mL磷酸、1 mL的2 mg/L的D₄-罗丹明B内标并充分混匀，取上述溶液6 mL待净化。 本实验采用PXC小柱(200 mg/6 mL)净化处理，即以5 mL甲醇与5 mL水活化柱子，然后上样，弃去流出液；加入8 mL 5%(质量分数)氨水甲醇溶液，收集流出液；将其在45 ℃减压蒸馏下蒸干，再用50%甲醇水溶液定容至1 mL，经0.45 μm滤膜过滤后待测。 在本实验方法下，对果汁中的罗丹明B残留量进行检测，均未发现阳性样品。

2 结果与讨论

2.1 D₄-罗丹明B合成反应的条件优化

为提高同位素原料D₄-邻苯二甲酸的利用率，考察了温度、投料比、反应时间对反应的影响，结果列于表 1。 可见，随着温度升高(Entry 1~6)，邻苯二甲酸酰化反应速率增大，175 ℃的反应温度下，收率可达42.3%。 增大3-羟基-N,N-二乙基苯胺的投料量(Entry 7~11)，反应收率提高；但继续增大配比时，副反应增多，收率有所降低。 随着反应时间的延长(Entry 8~16)，反应收率出现明显增加，并在反应时间为4 h时，反应收率达到67.2%；但进一步延长反应时间，反应收率有所降低。 综合对以上因素的考察，优选邻二氯苯为溶剂，n(邻苯二甲酸)∶n(3-羟基-N,N-二乙基苯胺)=1∶1.4，反应温度为175 ℃，反应时间4 h。

表 1

Table 1

表 1(Table 1)

表 1 罗丹明B合成反应的优化条件 Table 1 Optimization of reaction conditions for the synthesis of rhodamine Ba Entry n(3-Diethylaminophenol)/mmol Time/h Temperature/℃ Yield/% 1 10 1 135 28.5 2 10 1 145 32.2 3 10 1 155 35.3 4 10 1 165 38.4 5 10 1 175 42.3 6 10 1 185 40.1 7 12 1 175 45.3 8 14 1 175 47.1 9 16 1 175 40.6 10 18 1 175 38.3 11 20 1 175 40.1 12 14 2 175 51.2 13 14 3 175 60.7 14 14 4 175 67.2 15 14 5 175 62.3 16 14 6 175 58.8 a.Reaction conditions: pathalic acid 10 mmol，solvent 1,2-dichlorobenzene(20 mL).

表 1 罗丹明B合成反应的优化条件 Table 1 Optimization of reaction conditions for the synthesis of rhodamine Ba

2.2 结构表征

合成得到的产品经MS、NMR等仪器进行了结构表征，纯度经HPLC确定。 产物经D₄-邻苯二甲酸与3-羟基-N,N-二乙基苯胺反应生成D₄-罗丹明B，产品中氘同位素丰度大于98.0%；采用HPLC测定产物化学纯度，其保留时间与天然丰度产品保留时间一致，产品纯度(内标法)大于98.0%。

图 1

Fig. 1

图 1 D4-罗丹明B多级碎片裂解示意简图 Fig. 1 Fragmentation pathway proposed for D4-rhodamine B

通过对比产品与天然丰度罗丹明B的MS数据，产品分子离子峰MS峰m/z＝447.15，为D₄-罗丹明B去氯离子峰，即[M-36]^＋峰，与天然丰度产品质谱分析相比，多出4个氢的相对分子质量，进一步确定为目标产物D₄-罗丹明B；由收集的D₄-罗丹明B的[M-36-4]⁺~[M-36]⁺峰强度计算，氘同位素丰度大于98.0%。 由产品D₄-罗丹明B的二级谱图可知，罗丹明B具体裂解如图 2所示：其中m/z=447为[M-Cl]⁺峰，m/z=403为[M-Cl-COOH]⁺峰，m/z=431为[M-Cl-OH]⁺峰，m/z=417为[M-Cl-OH-CH₃]⁺峰，m/z=389为[M-Cl-COOH-CH₃]⁺峰，m/z=359为[M-Cl-COOH-CH₂CH₃-CH₂CH₃]⁺峰。

图 2

Fig. 2

图 2 D4-罗丹明B的氢谱核磁共振简图 Fig. 2 Structural diagrams 1H NMR scans for D4-rhodamine B

由产品的¹H NMR核磁谱图分析可知，¹H NMR(600 MHz，CDCl₃),δ:6.56~6.58(d,2H,J=12 Hz为(5)位置质子峰,δ 6.44~6.45(d,2H,J=6 Hz)为(4)位置氢信号峰,δ 6.32~6.34(dd,2H,J₁=12 Hz,J₂=6 Hz)为(3)位置氢信号峰,δ 3.34~3.37(q,8H,J=6 Hz)为(2)位置氢信号峰),δ 1.15~1.17(t,12H,J=6 Hz)为(1)位置氢信号峰；1.55和7.26为溶剂峰。 谱图显示为含6个苯环氢以及20个乙基氢。 与天然丰度罗丹明B对比，表明苯环上的4个H原子被D原子取代，证明产品与目标产物D₄-罗丹明B化学结构一致。

2.3 D₄-罗丹明B的应用

2.3.1 罗丹明B标准工作液

分别配制浓度为200 mg/L罗丹明B标准液、罗丹明B内标液。 罗丹明B标准工作液：分别移取1 mg/L的罗丹明B标准液、罗丹明B内标液，以蒸馏水配制成浓度在0.05~50 mg/L的7个不同浓度水平的罗丹明B标准工作液，工作液中含内标物2 mg/L D₄-罗丹明B。

2.3.2 线性关系与检测限考察

以罗丹明B标准工作溶液分别进样10 μL，记录离子流图。 并以标样峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，样品浓度为横坐标，进行线性回归。 其回归方程为：Y=8164.3+17537.62X，R=0.9996。 用空白样品提取液进行加标实验，在信噪比大于3的条件下均能检出，将此定为检测限，得到罗丹明B的最低检出限为5 μg/kg。

2.3.3 回收率实验

在上述实验方法下，对果汁中的罗丹明B残留量进行检测，均未发现阳性样品。 对样品A进行加标回收率测试，在果汁样品中加入3个浓度等级的罗丹明B标准溶液，再按上述条件进行样品前处理，并在相同的实验方法下各平行测定6次，得到的罗丹明B回收率在96.4%~103.4%之间(见表 2)，表明D₄-罗丹明B在食品安全领域中违禁色素的检测中有良好的应用前景。

表 2

Table 2

表 2(Table 2)

表 2 加标回收率及相对标准偏差(n=6) Table 2 Recoveries and relative standard deviation of rhodamine B in fruit juice samples Entry Rhodamine B/(μg·g-1) Recoveries/% Average/% RSD/% Ⅰ 1 99.8 96.7 97.9 98.5 96.4 98.1 97.7 1.0 Ⅱ 10 100.8 97.9 99.9 100.6 100.9 98.9 99.8 1.1 Ⅲ 50 103.4 102.6 101.8 102.7 101.8 100.7 102.2 1.2

表 2 加标回收率及相对标准偏差(n=6) Table 2 Recoveries and relative standard deviation of rhodamine B in fruit juice samples

总之，采用D₄-罗丹明B内标试剂，可对果汁中罗丹明B色素残留检测，具有快速、灵敏准确的特点。 本研究对于罗丹明B的检出限和回收率指标达到了较高的水平，对比我国出入境标准SN/T 2430-2010检出限0.005 mg/kg，农业行业标准NY/T 2656-2014检出限1 μg/kg，采用罗丹明B内标最低检测限可达5 μg/kg，在加标回收率等方面也有大幅提高，检测限与精密度都满足痕量分析要求。

3 结 论

以D₁₀-邻二甲苯为同位素标记起始原料，以D₄-邻苯二甲酸法合成得到稳定同位素氘标记D₄-罗丹明B，收率为65.2%，并经MS、NMR等技术手段鉴定其结构正确，化学纯度可达98.0%以上，氘同位素丰度高于98.0%，未出现同位素丰度稀释。 采用同位素稀释质谱法(IDMS)将其作为内标用于果汁样品中罗丹明B的检测，结果表明，在0.05~50 mg/L范围内呈良好的线性关系，其检出限为5 μg/kg，回收率为96.4%~103.4%，相对标准偏差(RSD)为1.0%~1.2%，在检测限、回收率和准确性方面显著优于现有方法，可作为内标试剂用于食品安全领域违禁色素的检测。

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