核黄素荧光猝灭法测定2,4,6-三硝基苯酚

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	Received: 2015-10-19

	Revised: 2015-12-21

	Published on Web: 2016-01-12


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黄小梅, 邓祥

四川文理学院化学化工学院, 特色植物开发研究四川省高校重点实验室四川达州 635000

收稿日期: 2015-10-19; 最后修改日期: 2015-12-21; 接收日期: 2016-01-12

基金项目: 四川省科技厅项目资助（2015JY0033）；四川省教育厅重点项目资助（13ZA0101）；“特色植物开发研究”四川省高校重点实验室项目资助（sctz201305）；四川文理学院重点项目资助（2014Z007Z）

通讯联系人: 黄小梅,高级实验师;Tel:0818-2760749;E-mail:dxw8066031@163.com;研究方向:光电分析化学

摘要: 基于核黄素与2,4,6-三硝基苯酚混合后产生荧光猝灭现象，建立了核黄素作为荧光探针测定2,4,6-三硝基苯酚的新方法。在0.2 mol/L磷酸盐（NaH₂PO₄-Na₂HPO₄）缓冲溶液（pH=6.2）中，响应时间为1 min时，检测2,4,6-三硝基苯酚的线性范围为2.5~1000 μmol/L，相关系数为0.9938，检测限为0.55 μmol/L。当加入5.00和20.00 μmol/L 2,4,6-三硝基苯酚到水样后，回收率在98.2%~103.5%之间。方法简便，选择性好，线性范围宽，可用于实际水样中2,4,6-三硝基苯酚的定性定量分析。

关键词: 核黄素三硝基苯酚荧光猝灭法

Fluorescent Quenching Method for the Detection of 2,4,6-Trinitrophenol Using Riboflavin

HUANG Xiaomei, DENG Xiang

Sichuan Key Laboratory of Characteristic Plant Development Research, Department of Chemistry and Chemical Engineering, Sichuan University of Arts and Science, Dazhou, Sichuan 635000, China

Abstract: A novel method for the determination of 2,4,6-trinitrophenol has been developed based on fluorescent quenching of riboflavin by 2,4,6-trinitrophenol(TNP) in aqueous solutions. The proposed fluorescent quenching method for TNP detection at pH=6.2 using 0.2 mol/L phosphate(NaH₂PO₄-Na₂HPO₄) as buffer solution responses within 1 min and with a broad linear relationship from 2.5 to 1000 μmol/L(r=0.9938). The limit of detection for TNP is 0.55 μmol/L. When 5.00 and 20.00 μmol/L TNP is added to different water samples, the recovery ranges from 98.2% to 103.5%. Furthermore, this method is simple, selective, and with wide linear range. Therefore, it can be applied in the determination of 2,4,6-trinitrophenol in real samples.

Key words: riboflavin trinitrophenol(TNP) fluorescent quenching method

近年来，随着工业的发展，环境污染问题越来越引起人们的关注，有关硝基酚类有机污染物的高灵敏度和高选择性检测，吸引了科研工作者们极大的研究兴趣^[1-3]。 2,4,6-三硝基苯酚(又称苦味酸，TNP)，是一类重要的硝基酚类有机化合物，在染料、医药、皮革等行业中被大量使用，它也广泛用于烟花、炸药和火箭燃料等的制造^[4]。 TNP的广泛使用已使其成为一类重要的环境污染物，对人类造成极大的危害。人体吸入TNP会影响中枢神经系统，引发呼吸道、胃肠道刺激，导致头晕、头痛、食欲减退、恶心呕吐、腹泻和发热等症状^{[2, 5]}。有时可引发末梢神经炎，心血管、肾脏、泌尿系统和肝脏损害疾病，影响新陈代谢等^[6-7]。因此，发展一种操作简便、响应快速、灵敏高的检测TNP的方法有着重要的现实意义。

目前，已报道的检测TNP的方法有电化学法^[8-9]、比色法^[10]、荧光法^[11-12]、拉曼法^[13]和质谱法^[14]等。这些方法均是基于合成出来的纳米材料，作为探针试剂检测TNP，具有操作方法复杂，检测周期长和成本高等缺陷。本文基于商品化试剂核黄素(Riboflavin)稳定的荧光性能，通过荧光猝灭原理实现TNP的定性定量检测。核黄素，又称维生素B₂，在440~500 nm波长光照射下发生黄绿色荧光，当加入TNP后，体系的荧光被猝灭，基于这种荧光猝灭的信号用来检测TNP。本方法操作简单，线性范围宽，灵敏度高，能有效实现水样中TNP的快速检测。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

F-2700型荧光分光光度计(日本日立公司)用于表征荧光光谱；用PHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器公司)调节测量和校正溶液pH；WFH-204B型手提式紫外灯(上海精科实业有限公司)；FA2104S型电子分析天平(上海光学仪器厂)。

Na₂CO₃、NaNO₃、K₂CO₃、Na₃PO₄、Na₂SO₄、Hg(NO₃)₂、AgNO₃、CaCl₂、CdCl₂、CuSO₄、FeCl₃、BaCl₂、CrCl₃、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄和核黄素均购买于国药集团化学试剂有限公司；苯酚(phenol)、三硝基甲苯(TNT)、二硝基甲苯(DNT)、三硝基苯酚(TNP)、硝基苯(NB)购买于阿拉丁试剂有限公司；0.2 mol/L磷酸盐(NaH₂PO₄-Na₂HPO₄)缓冲溶液用于调节体系的pH值，所用试剂均为分析纯，实验用水均为去离子水。

1.2 实验方法

于5 mL 塑料离心管中依次加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=6.2)2 mL、2×10^-6 g/L核黄素溶液1 mL和不同浓度的TNP、适当体积的水补充总体积至4 mL，均匀混合后在室温(约25 ℃)下进行荧光检测，荧光发射波长为525 nm，激发波长为440 nm，电压400 V。实验中每个样品都平行测定3次，计算出误差棒(error bar)和相对标准偏差(RSD)。

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱

实验考察了TNP对核黄素的荧光光谱的影响。如图 1所示，在440 nm的激发波长下，核黄素在525 nm处有最大荧光发射，强度为4848.52。当TNP加入后，核黄素在525 nm处的荧光被明显猝灭，并且随着TNP浓度的增加，核黄素在525 nm处的荧光被猝灭的程度越来越大。直到加入1000 μmol/L TNP时，荧光强度猝灭到最低值432.03基于TNP加入前后核黄素体系荧光强度的变化，将核黄素作为荧光探针实现对TNP的检测。

图 1 TNP加入后核黄素荧光的变化 Fig. 1 Fluorescence spectra of riboflavin in the presence of TNP c(Riboflavin)=5.0×10^-7 g/L; c(TNP)/(μmol ·L^-1):a~j.0,2.5,5,10,25,50,100,250,500,1000

2.2 pH条件优化

首先考察了体系pH值对检测TNP的影响。以525 nm处的荧光强度值作为比较的依据。如图 2所示，I₀(曲线a)代表空白体系的荧光强度值；I(曲线b)代表加入目标物TNP后混合体系的荧光强度值，I₀/I(曲线c)为TNP对体系荧光的猝灭效率。在考察的不同pH值范围内，空白体系的荧光强度和加入TNP后混合体系的荧光强度波动不大，说明此方法检测TNP受pH值影响较小。对荧光猝灭效率I₀/I进行分析，在pH值为6.2时，荧光猝灭效率I₀/I最大(I₀/I=4.90)，因此，我们确定pH=6.2为检测TNP最佳的检测缓冲条件。

图 2 检测TNP的pH优化 Fig. 2 Effect of pH on the detection of TNP pH:4.4,5.8,6.2,7.0,7.4,8.0,9.3; c(Riboflavin)=5×10^-7 g/L; c(TNP)=500 μmol/L. I₀(a) represents fluorescent intensity of Riboflavin(control sample); I(b) represents fluorescent intensity of Riboflavin after the addition of TNP; I₀/I(c) represents y quenching efficiency after the addition of TNP

2.3 反应时间的优化

此外考察了TNP检测体系的反应动力学行为，如图 3所示，考察了不同时间条件下体系的荧光强度变化情况。核黄素空白实验荧光强度变化很小，几乎可以忽略，说明核黄素在此实验条件下荧光比较稳定，基本不受时间影响。当加入TNP后，混合体系的荧光急剧降低，随着时间的变化，荧光强度变化不大，猝灭这说明此方法检测TNP响应快速。考虑到检测TNP的快速性和稳定性，我们确定最佳检测TNP的时间为1 min。

图 3 检测TNP的反应动力学图 Fig. 3 Kinetic behaviors of the TNP detection system Time/min:0,2,5,10,20,40,60; c(Riboflavin)=5×10^-7 g/L; c(TNP)=500 μmol/L

2.4 标准曲线

经过条件优化，在最佳实验条件下，基于图 1荧光光谱的变化绘制了lg (I₀/I)-c的线性曲线图，并对525 nm处的荧光强度值进行了线性拟合。如图 4所示，将核黄素空白体系在525 nm处的荧光强度设为I₀，加入TNP后混合体系的荧光强度设为I，二者比值的对数lg (I₀/I)与TNP的浓度c在2.5~1000 μmol/L范围内呈现良好的线性关系，线性方程为lg (I₀/I)=0.022+0.001c(μmol/L)，相关系数为0.9938，检测限(3σ，n=11)为0.55 μmol/L。

图 4 不同TNP浓度下的标准曲线图 Fig. 4 Linear calibration plot of Riboflavin in the presence of different concentrations of TNP c(TNP)/(μmol ·L^-1):0,2.5,5,10,25,50,100,250,500,1000; c(Riboflavin)=5×10^-7 g/L

2.5 荧光猝灭机理探讨

为探讨TNP对核黄素的荧光猝灭机理，进行了荧光寿命的表征。通过瞬态荧光仪测出来的荧光衰减数据(图 5)用双指数拟合得出：核黄素有两个荧光寿命，其中以0.1265 ns为主；加入100 μmol/L TNP后，体系的荧光寿命仍然为两个寿命，其中以0.1463 ns为主。在误差范围以内，可以认为核黄素荧光体系，在加入TNP前后，荧光寿命变化不大。因此，我们推测该体系为静态猝灭。

图 5 TNP的荧光寿命测量 Fig. 5 The photoluminescence lifetime for TNP detection system using riboflavin c(Riboflavin)=5×10^-6 g/L; c(TNP)=100 μmol/L

2.6 选择性和干扰实验

考察了共存无机酸根、金属离子和一些结构相似有机物对体系的影响。如图 6所示，当体系中加入相同浓度的其他物质时，荧光猝灭效率(I₀-I)/I₀非常小，说明其它物质加入后基本不改变体系的荧光强度；也只有当加入TNP的样品中时，荧光猝灭效率(I₀-I)/I₀明显变大，说明该检测TNP的方法对物质有很好的选择性。同时，进行了干扰实验，结果列于表 1。可见，浓度放大100倍的Na₃PO₄、Na₂CO₃、Na₂SO₄、NaNO₃、NaCl、CaCl₂、MgCl₂、BaCl₂、KCl、FeCl₃对TNP的测定实验没有干扰；50倍的CuCl₂、CdCl₂、AgNO₃对实验没有干扰；20倍的硝基苯(NB)、二硝基甲苯(DNT)、三硝基甲苯(TNT)对实验也没有干扰。

图 6 TNP对其它物质的选择性 Fig. 6 Selectivity for the detection of TNP All the concentrations of them are 500 μmol/L; c(Riboflavin)=5×10^-7 g/L

表 1 共存物干扰实验 Table 1 Tolerance of foreign substances

2.7 样品分析

分别取某印染厂、药厂和医院的水样，经过滤出去杂质后按1.2节试验方法进行测定，采用加标回收法做回收率实验，实验结果列于表 2。从样品分析结果可以看出，当加入5.00和20.00 μmol/L TNP到水样品后，本方法对测定TNP的回收率和RSD分别为98.2%~103.5%和0.6%~1.7%。故此方法可用于实际水样品中TNP的测定。

表 2 实际水样品中TNP检测 Table 2 Determination of TNP in different water samples

3 结论

基于TNP对核黄素的荧光猝灭作用，建立了核黄素作为荧光探针测定TNP的新方法。该方法检测TNP的线性范围为2.5~1000 μmol/L，检测限为0.55 μmol/L，响应速度为1 min，线性范围广，灵敏度高，响应迅速，并且操作简单，所需试剂成本低，荧光稳定，对所检测物质具有较好的选择性。当加入5.00和20.00 μmol/L TNP到水样后，回收率和RSD分别为98.2%~103.5%和0.6%~1.7%。该方法有望应用于生活和工业污水中TNP的检测。

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