抗菌纤维具有抑制微生物生长繁殖的能力，系纤维上接枝抗菌基团或浸渍抗菌添加剂制备的织物原料，是近年来热点方向之一[1]。 制备抗菌纤维材料的方法有共混纺丝法，后整理法和接枝改性法。 共混纺丝法是将抗菌剂与原料共混纺丝，例如Yeo等[2]以共混纺纱技术制备出聚丙烯/银纳米复合纤维。 后整理法是以抗菌液浸渍或涂覆纤维,例如Ye等[3]用正丙烯酸丁酯为核,以壳聚寡糖为壳的溶液为介质,对纤维进行涂层、浸扎-焙烘制，制备出抗葡萄球菌达99%以上的抗菌纤维。 由于抗菌剂未与纺丝原料形成共价键，容易脱落，因此，共混纺丝和浸渍法制备的纤维均难以持久保持抗菌性[4]。 接枝改性法是通过配位或共价键束缚抗菌材料于纤维表面，赋予纤维抗菌性能的加工方法[5]。 Fillat等[6]用天然酚类接枝亚麻纤维，制得接枝天然酚类纤维。 与共混纺丝和浸渍法相比较，接枝改性法通过高键能的配位键或共价键束缚抗菌材料，制备的抗菌纤维抗菌性能稳定持久，具备深入系统研究的价值。
周小华等[7]用壳聚糖和明胶共价聚合形成壳聚糖-明胶共聚物，该共聚物既有明胶对皮肤的良好相容性及营养，又具有壳聚糖的吸附、成膜、吸湿、抗菌、保湿性能。 水解小麦醇溶肽是小麦醇溶蛋白的蛋白酶水解物，由于相对分子质量显著降低，水溶性增加，可广泛用于食品、化妆品等领域。 壳寡糖系壳聚糖的部分水解产物，为广谱抗菌剂,可抑制数十种微生物的生长[8]。 微生物转谷氨酰胺酶 (MTGase)催化酰基转移反应，从理论上讲，在适宜条件下，MTGase可催化水解小麦醇溶蛋白合成壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物。 至今，尚未见MTGase催化合成壳寡糖-水解醇溶肽共聚物材料方面的报道。 本文拟以壳寡糖和水解小麦醇溶蛋白为原料，用MTGase催化合成壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物，研究优化合成工艺条件，分离接枝共聚物，进行波谱和主要理化性质表征，旨在提供一种以壳寡糖与植物醇溶蛋白合成的抗菌蛋白接枝共聚物纤维材料。
麦醇溶蛋白(相对分子质量4.0×104，含蛋白10%，分析纯，重庆海帆生化有限公司)，壳寡糖(相对分子质量≤3.2×106，生物试剂，青岛金湖甲壳制品有限公司)；微生物转谷氨酰胺酶(MTGase，酶活力1.5 U/mg，生物试剂，江苏泰兴市一鸣精细化工公司)。 氨基葡萄糖盐酸盐(生物试剂，中国医药集团上海化学试剂公司)，对—二甲基氨基苯甲醛(分析纯，Adamas Reagent Limited Company)，牛血清白蛋白(6.7×104)(生物试剂国药集团化学试剂有限公司)，葡聚糖凝胶G75(生物试剂，上海源叶生物科技有限公司)，溶菌酶(1.44×104)(生物试剂，上海源聚生物科技有限公司)，胰蛋白酶(2500U)(生物试剂，中国医药集团上海化学试剂公司)，其余试剂均为分析纯。
550Ⅱ型红外光谱仪(美国Nicolet公司)，Agilent1200型液相色谱系统(德国安捷伦科技有限公司)，DTG-6H型差热分析仪(日本SHIMADZU公司)，EX-CaHjBur型X射线能谱仪(XRD，美国Jodam公司)，FD-1型真空冷冻干燥机(北京德天佑科技发展有限公司)，L-8800型全自动氨基酸分析仪(日本日立公司)，pHS-3C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)，TGL-16C型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，超滤系统(上海摩速科学器材有限公司)，凝胶层析系统(上海沪西分析仪器有限公司，北京瑞达恒辉科技发展有限公司)。
MTGase粗粉搅拌分散于100倍体积的KH2PO4-NaOH缓冲液(0.1 mol/L，pH=6.45)中，5000 r/min离心10 min。 取上清液，用稀盐酸调节pH值至4.28，5000 r/min再次离心10 min。 取上清液，用截留相对分子质量为1×104的PS型超滤器在0.2 MPa下超滤浓缩，直至无滤过液时止。 收集超滤截留液，于-40 ℃、60 Pa下冷冻干燥24 h，获得纯化MTGase冻干粉，其MTGase 比活力为1.2 U/g，4 ℃下保存备用。
适量麦醇溶蛋白高速分散于100倍体积的Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液(0.1 mol/L,pH=10)中，再加入0.5%胰蛋白酶，在55 ℃下搅拌水解40 min，接着升温至85 ℃，保持10 min，灭活胰蛋白酶后用3000 r/min的速度离心10 min，收集上清液，在60 ℃左右、-0.09~-0.1 MPa浓缩，直至截留液中蛋白质含量约10%时，即获得水解麦醇溶肽浓缩液，最后用甲醛法测定其平均相对分子质量为3250，4 ℃保存备用[9]。
2 g壳寡糖先用100 g去离子水溶解，配制成2%(质量比)的溶液。 再按照2%壳寡糖溶液/水解麦醇溶肽浓缩液体积比1∶5的比例，将二者混合均匀，用稀盐酸调节pH值至6.0～6.5，接着升温至50 ℃，然后按MTGase冻干粉/壳寡糖质量比1∶50的比例加入纯化MTGase冻干粉，进行接枝反应4 h。 反应完成后，3000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀用去离子水反复搅拌洗涤、离心，如此重复至洗涤液无双缩脲反应时止。 最后将沉淀在-50 ℃、40～60 Pa下冷冻干燥24 h，即获得壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物，备用。
精确称取定量壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物冻干粉，用全自动氨基酸分析仪分析氨基酸分析比。 精确称取定量试样，按照冉兰等[10]采用的比色法测定盐酸氨基葡萄糖片含量的方法，来进行氨基葡萄糖分析。 取少许干燥试样，加入适量KBr，用玛瑙研钵仔细研磨后压片，用红外光谱仪在4000～400 cm-1范围扫描分析红外光谱。 分别称取1.00 g壳寡糖，麦醇溶蛋白和壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物，各加入9.00 g无水碳酸钙，充分分散后各置于坩埚中，放入炉中以5 ℃/min的速率程序升温至800 ℃，以ΔT=Ts-Tr对时间t作图，Ts、Tr分别表示样品和参比物各自的温度，得DTA曲线。 取少量样品，用X射线能谱仪分析。 采用凝胶过滤色谱法测定共聚物的相对分子质量[11]。 5 g壳寡糖-水解麦醇溶肽冻干粉分别用100 mL 1%(体积分数)HCl、100 mL 1%(体积分数)CH3COOH、1%(m/m)NaOH等溶液在室温下搅拌溶解6 h，4000 r/min离心15 min，弃上层清液，沉淀于110 ℃干燥24 h后置于干燥器中平衡，最后精确称量并计算其溶解度。
MTGase催化水解麦醇溶肽与壳寡糖的反应式如Scheme 1。 从该式可知，合成壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物需要底物水解麦醇溶肽、壳寡糖，MTGase及适宜的条件。
图 1为MTGase催化合成壳寡糖-水解麦醇溶肽的反应时间进程曲线。 从图 1可知，在50 min以内，共聚物的生成率随反应时间增加而上升，其线性方程为y=-0.0152x2+1.8375x+0.6583(R2=0.9988)，超过50 min，共聚物的生成率不再随反应时间增加而上升。 可以解释为，MTGase催化合成壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物的反应过程由底物壳寡糖和水解麦醇溶肽扩散至酶的活性部位，并与酶形成中间复合物、发生酶促反应和产物壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物扩散离开酶3个阶段组成，因此，该共聚物的生成速率受到底物和产物扩散及MTGase活性控制。 在最初阶段，底物充足且MTGase处于活性最高水平，扩散至酶活性部位并与之形成中间复合物的底物不断增加，共聚物的生成速率不断上升；随着聚合反应的进行，因浓度减少导致的底物扩散势逐渐降低，分子增大造成的共聚物扩散速度减小[12]及蛋白质变性引发的酶活性不断下降，致使共聚物的生成速率不断降低并在50 min附近不再增加。 因此，适宜的合成时间为50 min。
以麦醇溶肽和壳寡糖的质量比(m1∶m2)为横坐标，共聚物的生成率为纵坐标，得出的关系曲线，见图 2。 从图 2可知，在麦醇溶肽与壳寡糖的质量比由m1∶m2=10∶1上升至40∶1区间，壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物的合成率逐渐上升，线性方程为y=-0.0089x2+0.9207x+42.4(R2=0.9943)；当该质量比超过m1∶m2=40∶1，共聚物生成率几乎不再变化。
Scheme 1指出，合成1分子壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物需要m分子壳寡糖和n分子水解麦醇溶肽，因此底物的质量比影响共聚物的生成率。
表 1为MTGase催化合成壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物的定性试验结果。 从表 1可以看到，无论是壳寡糖、水解麦醇溶肽或是壳寡糖/水解麦醇溶肽溶液，还是MTGase溶液，均无黄色沉淀生成，只有壳寡糖/水解麦醇溶肽/MTGase混合溶液(处理5)出现大量淡黄色沉淀。 由此推测，在处理5中，可能发生了MTGase催化的壳寡糖与水解麦醇溶肽间的化学反应，生成了水溶性不佳的共聚物。
图 3为壳寡糖和黄色沉淀的红外吸收光谱。从图 3谱线a可知，壳寡糖为氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接成的线性高分子，从图 3可以看出，有—OH(ν O—H 3143 cm-1,1415 cm-1)、少量酰胺基(ν —CO—NH—，1635 cm-1；δ N—H+ν C—N，1599 cm-1)、醚键(ν C—O—C，1092 cm-1)。
水解麦醇溶肽是麦醇溶蛋白的酶水解产物，由18种L-氨基酸组成，从图 3谱线b可知，其存在的基团以及红外吸收峰有—OH(ν O—H，3165 cm-1,1418 cm-1)、—CH3(νs C—H，2973 cm-1；νs C—H，2880 cm-1)、—CH2—(νs C—H，2920 cm-1)、酰胺基(ν —CO—NH—，1658 cm-1；δ N—H+ν C—N，1585 cm-1)。
图 3谱线c为壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物的红外光谱。 从图中可以看出，该共聚物除了有壳寡糖的红外吸收外，还分别出现ν CH(3015 cm-1)、νs C—H(—CH2—)(2959 cm-1)、ν —CO—(—COOH)(1743 cm-1)和νCC(1456 cm-1)是蛋白的吸收峰。 由此可以推断，该共聚物中既存在着壳寡糖，又存在醇溶蛋白组分。由酰胺键吸收波数显著增加，确定合成了共聚物。
图 4为壳寡糖的TGA曲线。 由图 4可知，壳寡糖在66.42 ℃处失水吸热，失重约17.936%；212.89 ℃处开始熔融，244.27 ℃处壳寡糖主链开始断裂，最后在680.37 ℃彻底分解，失重72.143%。
图 5为碳酸钙分散麦醇溶蛋白的TGA曲线。 由图 5可知，麦醇溶蛋白在44.73 ℃处失水吸热，失重约1.786%；185.48 ℃处开始熔融并发生分解，386.41 ℃处主链开始断裂，失重约11.652%，其中包含麦醇溶蛋白和碳酸钙中的少量结晶水；最后在728.87 ℃处为碳酸钙分解，失重约38.889%。 通过计算，9 g CaCO3分解产生3.96 g CO2，占总质量的39.6%，与失重的比例大致相当。
图 6为壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物的TGA曲线。 由图 6可知，共聚物在60.91 ℃处失水吸热，失重约8.34%；264.42 ℃处熔融，387.55 ℃处主链开始断裂并分解，整个过程失重72.665%。 与壳聚糖相比，熔融温度和主链断裂温度均提高，可能是聚合物分子内以及分子间的氢键相互作用增多，而断裂氢键需要额外增加能量所致。 正是由于这种氢键相互作用，可能使该共聚物拥有更好的热稳定性等性质。
图 7谱图a为壳寡聚糖的XRD图，谱图b为壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物的XRD图。 由图 7可知，壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物在2θ=20°左右有强吸收峰，而壳寡聚糖在2θ=11°和25°左右有强吸收峰。 即证明壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物是不同于壳寡糖的一种物质。
表 2为壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物的氨基酸组成。 从表 2可知，共聚物的氨基酸种类与麦醇溶蛋白一致，但各氨基酸的含量和百分比发生变化。
MTGase催化蛋白质或肽分子中的谷氨酰胺(Gln)与伯胺基反应[13]，生成交联衍生物。 因此，只有含Gln的水解麦醇溶肽可与壳寡糖作用，生成壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物，所以，共聚物的氨基酸种类及含量即反映含谷氨酰胺水解麦醇溶肽的氨基酸组成及比例。 从表 2可知，共有17种氨基酸与皮肤胶原蛋白类似，因此可推测该聚合物与皮肤有良好的亲和性；从表 2还可以看出，其中有11种氨基酸含量基本不变，这些氨基酸主要为脂肪族氨基酸，或极性氨基酸，其中，脂肪族氨基酸有利于改善聚合物的舒适性[14]，而极性氨基酸可与水分子形成氢键，有利于保持共聚物适宜的吸湿性；酸性氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)平均增加19.6%，这是因为MTGase催化的反应需选择游离酰胺基，而两者多相互“临近”在同一短肽所致。 Gln为MTGase的底物，在该酶催化下可与壳寡糖发生脱氨聚合反应；而天冬酰胺(Asn)则可能为MTGase的竞争性抑制剂[15]，虽然它与Gln竞争酶的结合位点，降低酶促反应速率，但是，作为织物用途的聚合物，Asn的水解物Asp呈负电荷，既可排斥同电荷的微生物而“抗菌”，又能避免与同带负电荷的皮肤“相贴”而产生不适感；碱性氨基酸赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)平均增加213%，含硫氨基酸蛋氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)增加167%，前者在生理和酸性条件下均带正电荷，既可与微生物细胞表面的负电荷蛋白质或多糖形成离子键相互作用而影响其生长发育，显示出“抗菌性”，又可与“相邻”聚合物的Asp或Glu结合而增加其强度；而后者、特别是Cys的剧增，表明聚合物中含有大量巯基，巯基的活性强，既容易给出孤对电子形成配位键，也容易氧化还原，形成共价连接。 因而，有利于改善织物强度、染色并“钝化”重金属。 此外，从该表还可知，聚合物水解醇溶肽中对紫外光有强吸收的芳香族氨基酸酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)含量减少47.23%，这表明，该聚合物对紫外光的吸收率显著降低，由紫外光引发的“升温效应”弱化，有益于改善其舒适性。 由此可以推测，合成的共聚物纤维材料具有抗菌，亲肤，舒适等特性。
图 8为壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物高效液相色谱。 由图 8可以看出，图中有7个峰，主要的成分为第2和第5号峰(按出峰先后顺序)，从峰面积可计算出，第2号峰面积占53.4%，第5号峰面积占27.2%，总和80.6%。
图 9为壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物凝胶过滤色谱图，与高效液相色谱图一样，凝胶过滤色谱图也反映出壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物有两种主要的成分。 然而毕竟凝胶过滤色谱没有高效液相色谱精确，全图中只有3个峰，高效液相色谱有7个峰。 接枝到壳寡糖上的麦醇溶蛋白多肽的数量有多有少，相对分子质量有大有小，而且有的分子是网状结构，所以壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物的相对分子质量分布很宽。从图 9可看出，一共3个峰，峰a的洗脱体积为144 mL；峰b的洗脱体积为306 mL；峰c的洗脱体积为468 mL。 根据文献[16]中介绍的方法，得公式Ve=-913lg Mw+4518，可计算出各自的相对分子质量分别为M1=66069、M2=41054、M3=27285。
从结果可看出，壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物的溶解性较差，这是因为壳寡糖分子链上存在大量氨基(—NH2)，其为亲水基团，而当壳寡糖在MTGase的作用下接枝上麦醇溶蛋白多肽后，分子链上的氨基(—NH2)大量被封闭，另外，麦醇溶蛋白的多肽链上本来就含有大量的疏水基团，这两方面的原因致使壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物的溶解性大大降低。 从表 3还可以看出，壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物在氢氧化钠中溶解度最大，这是因为壳寡糖上的氨基(—NH2)被封闭后，还存在羟基(—OH)，这可以电离出氢离子，与OH-反应，所以壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物在碱溶液中的溶解度比酸溶液中高。
本文研究了壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物在pH值1～14的条件下的溶解度。 共聚物在不同pH值条件下的溶解度如图 10所示。
在pH值较低的溶剂中，H+的浓度比较高，导致壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物的解离度小，溶解度小；从pH=9开始，溶解度迅速增大，这个阶段影响溶解度的主要因素为酸碱度，较强的碱性溶液中含有大量OH-，OH-增大壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物的解离度，溶解度增大；而当pH=12以后，溶解度增加缓慢，这个阶段影响溶解度的主要因素是壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物的相对分子质量，由于相对分子质量太大，且分子上的疏水基团多，因此溶解度在pH=12以后增加缓慢。
以MTGase催化合成壳寡糖-水解麦醇溶肽共聚物，当壳寡糖/水解麦醇溶肽质量比为1∶40，在pH值6.00～6.50、50 ℃下搅拌反应50 min，共聚物的生成率可达到60％～70％。 红外光谱分析、差热分析、XRD分析结果表明，成功地将壳寡糖分子接枝水解麦醇溶肽。 HPLC分析表明，此共聚物主要由两个组分构成。 由氨基酸分析可推测合成的共聚物纤维材料具有抗菌、亲肤、舒适等特性。
2016,
Vol. 33
Issue (3): 284-292
PDF
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