有机化学  2016, Vol. 36 Issue (3): 664-669   PDF    
新型二氢叶酸还原酶抑制剂的合成及生物活性测试
张袁魁 , 陈简 , 詹晓平 , 徐赟 , 刘增路 , 毛振民     
上海交通大学药学院 上海 200240
国家科技重大新药创制专项(No. 2010ZX09401-404)
*通讯作者：毛振民, E-mail: zmmao@sjtu.edu.cn
摘要：以氯乙腈和2-噻吩甲醛为原料, 通过接合经缩合、环合、还原、硝化等步骤合成的两个关键中间体1c和2d, 设计合成了两个新型二氢叶酸还原酶抑制剂的衍生物3c和4b, 其结构经1H NMR、13C NMR和MS方法验证.采用噻唑蓝法对目标化合物进行了抗肿瘤活性测试, 结果表明3c对筛选的5种肿瘤细胞株的抑制活性均比阳性对照药洛美曲索、甲氨蝶呤和培美曲塞强, 4b对Hep-G2的抑制活性比阳性对照药洛美曲索、甲氨蝶呤和培美曲塞强, 而且3c和4b对正常细胞株——人脐带内皮血管平滑肌细胞的抑制活性明显比甲氨蝶呤和培美曲塞弱.
关键词：二氢叶酸还原酶抑制剂    抗肿瘤活性    合成    
Synthesis and Bioactivity of Novel Dihydrofolate Reductase Inhibitor
Zhang Yuankui , Chen Jian , Zhan Xiaoping , Xu Yun , Liu Zenglu , Mao Zhenmin     
School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240
Received: September 29, 2015; published: October 30, 2015; published online: November 6, 2015
Project supported by the National Significant and Special Project of New Created Drugs (No. 2010ZX09401-404)
Abstract: In order to obtain antitumor candidates with potent activity, two novel analogues of dihydrofolate reductase (DHFR) inhibitors 3c and 4b were designed and synthesized. The synthetic routes were as follows: 1c was synthesized using chloroacetonitrile, carboxylate and 2, 4, 6-triamino-pyrimidine as raw materials by condensation, cyclization and reduction. 2d was synthesized using 2-thiophene formaldehyde and glutamate as raw materials by nitrification, oxidation, condensation and reduction. Then target product 3c was synthesized using 1c and 2d as raw materials by reductive amination and hydrolysis. Target product 4b was synthesized using 1c and 2d as raw materials by 2 steps of reductive amination and hydrolysis. The structures of target products were confirmed by the way of 1H NMR, 13C NMR and MS. The in vitro antitumor activities of target products were evaluated by MTT method. The results showed that 3c exhibited stronger antitumor activity against screened five tumor cell lines (CCRF-CEM, L1210, A549, SGC-7901 and Hep-G2) than the positive control lometrexol, methotrexate and pemetrexed. 3c exhibited stronger antitumor activity against Hep-G2 than the positive control lometrexol, methotrexate and pemetrexed. In addition, 3c and 4b showed much weaker antiproliferative activity toward normal cell SMC than the positive control methotrexate and pemetrexed. This research could provide a theoretical basis for the development of new antitumor drugs.
Key Words: DHFR inhibitor    antitumor bioactivity    synthesis    

癌症是危害人类健康最主要的杀手之一, 随着人们生活水平的提高及环境的改变, 癌症的发病率正呈现逐年增加的趋势[1].抗癌药物的研发一直是全球关注的焦点, 其中二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)作为DNA代谢途径中最重要的酶之一, DHFR抑制剂作为抗肿瘤药物受到了科研工作者的关注[2].培美曲塞(pemetrexed)最早于1992年被Taylor等年和姓与文献不符[3]合成出来(图 1), 随后的研究发现, 它是多靶点的抗肿瘤药, 具有抗胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS)、二氢叶酸还原酶以及甲酰甘氨酰胺核苷酸转移酶(glycinamide ribonicleotide formyltransferase, GATFT)等的作用[4], 甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)则是经典的二氢叶酸还原酶抑制剂(图 1)[5].培美曲塞和甲氨蝶呤均具有良好的抗肿瘤活性(文献[6]报道两者抑制CCRF-CEM的IC50值分别为: pemetrexed 155 nmol/L, MTX 78 nmol/L). LY309887是洛美曲索(lometrexol)的苯环被噻吩环取代而衍生出来的化合物, 其对人白血病细胞株(CCRF-CEM)的半数抑制率(以IC50值表示)达到2.89 nmol/L, 相比较于lometrexol (IC50＝9.93 nmol/L), 抑制活性提高了3.4倍[7a, 7b].本文以培美曲塞和甲氨蝶呤作为先导化合物, 对其进行结构改造.因为两者的母核结构吡咯并嘧啶与吡嗪并嘧啶两者的差别对终产物活性造成的差异并不大, 但是由吡嗪环而得的蝶啶环在化学性质上相对地不稳定, 而且所得的化合物溶解性较差; 但是如果含其它杂原子的杂环, 往往都导致活性下降[8a～8c].所以本文选取了培美曲塞中的吡咯并嘧啶稠环作为母核结构, 以提高化合物的脂溶性.同时参考LY309887的结构, 将叶酸中对氨基苯甲酸区域的苯环用噻吩环替代, 另外, 对吡咯并[2, 3-d]嘧啶母核结构的1位氨基处进行乙基化修饰, 以期获得更好抗肿瘤活性的目标化合物.

图 1 化合物洛美曲索、LY309887、培美曲塞、甲氨蝶呤的化学结构 Fig 1 Structure of compounds lometrexol, LY309887, pemetrexed and methotrexate
1 结果与讨论
1.1 合成

本文的合成路线如Scheme 1所示.

图式1 目标化合物合成路线 Scheme1 Synthetic route of target compounds

化合物1b的合成参考2-氨基-4-氧代-5-氰基-4, 7-二氢吡咯并[2, 3-d]嘧啶的合成方法[9a, 9b].相比于Gangjee等[10]用Pd-BaCO3为催化剂, 氢化还原2-氨基-5-溴-3, 4-二氰基-1H-吡咯上的溴, 然后与氯甲脒缩合成嘧啶环得1b的方法, 前者使用的原料氯乙腈和甲酸甲酯要廉价和易得, 且对环境污染较小.制备1a的后处理过程中需要控制好条件, 防止产物自身发生聚合.本文采取在室温下将滤液浓缩后直接与2, 4, 6-三氨基嘧啶成环后得到1b.随后1b溶于甲酸, 由活化过的铝镍合金催化还原, 即可得到1c[11].由于1c含有醛基, 不稳定, 不宜长期保存, 所以需现制现用.

化合物2b, 如果根据文献[12]的方法, 由2-噻吩甲酸经硝化来制备, 结果会因生成4-硝基-2-噻吩甲酸异构体, 经钡盐分离所得5-硝基-2-噻吩甲酸纯品收率都比较低.因而本文改用2-噻吩甲醛经发烟硝酸硝化生成2a, 再经过氧化氢氧化制得2b, 后处理方便, 收率也有所提高, 两步总收率为54%.随后2b与谷氨酸二乙酯盐酸盐进行缩合酰化反应得到化合物2c, 为了加快反应速度, 先加入2-氯-4, 6-二甲氧基三嗪(CDMT)作为羧基活化剂, 加入N-甲基吗啡啉(NMM)作为催化剂, 产率较高, 后处理也比较容易.化合物2d由2c在铁粉和冰醋酸作用下还原硝基得到.

化合物3c的合成参考文献[13a～13c]. 1c和2d在酸性条件下发生还原胺基化反应生成亚胺的中间体产物3a.但其由于形成分子内氢键, 不能被彻底还原, 所以本文采取在反应完成后, 不进行后处理, 而是先将它们以硼烷-三乙胺的络合物还原成胺的形式(即3b), 再纯化分离.这样一方面可以避免亚胺在分离过程中由于变质而引入新的杂质, 减少损失; 另一方面也可以简化操作过程.随后终产物3c由3b在甲醇中以氢氧化钠将酯基水解、中和得到.

化合物4b的合成参考文献[14], 4a由化合物3b的2位氨基和乙醛经过还原胺化反应得到.一般芳香族胺的N-烷基化反应是通过在碱性条件下与不同的卤代烷来进行的, 但考虑到化合物3b除了桥链氮原子外其他部位也还有很多氮原子, 若用卤代烷的方法来引入烷基的话, 可能使得反应的副产物增多, 产率低且产物难以分离.所以本文采用条件温和的胺的还原烷基化反应, 用40%的乙醛溶液在酸性条件下进行反应, 再用NaBH3CN还原反应生成的Schiff碱, 反应一步完成(Scheme 1).

1.2 抗肿瘤活性

本研究采用经典的MTT法, 以洛美曲索、培美曲塞、甲氨蝶呤作为阳性对照, 对两个目标化合物3c和4b进行了抗肿瘤活性测试.分别选用1种正常细胞株——人脐带血内皮血管平滑肌细胞(SMC), 五种肿瘤细胞株——人白血病细胞株(CCRF-CEM)、小鼠白血病细胞株(L1210)、人肺癌细胞株(A549)、人胃癌细胞株(SGC-7901)和人肝癌细胞株(Hep-G2)培养, 测得化合物3c、4b、Lometrexol、Pemetrexed、MTX对于以上6种细胞株的IC50 (mol/L)如表 1所示.

表 1 化合物对肿瘤细胞株和正常细胞株的生物活性数据表 Table 1 Inhibitory effects of compounds against cell lines

表 1的结果表明目标化合物3c对筛选的5种肿瘤细胞株的抑制活性均比阳性对照药洛美曲索、甲氨蝶呤和培美曲塞强, 而目标化合物4b对L1210、SGC-7901及Hep-G2均有抑制活性, 但仅对Hep-G2的抑制活性比阳性对照药洛美曲索、甲氨蝶呤和培美曲塞强, 其中3c对CCRF-CEM的抑制活性是洛美曲索的2.3倍, L1210的抑制活性是洛美曲索的7.6倍, 对A549的抑制活性是培美曲塞的7.8倍, 对SGC-7901的抑制活性是洛美曲索的1.6倍, 对Hep-G2的抑制活性是甲氨蝶呤的3.1倍. 4b对Hep-G2的抑制活性是洛美曲索的1.6倍, 培美曲塞的1.1倍, 甲氨蝶呤的1.7倍.并且3c和4b对正常细胞株的抑制活性明显比阳性对照药弱, 其中甲氨蝶呤对SMC-7901的抑制活性是3c的5.2倍, 是4b的12.9倍.因此目标化合物3c和4b可以作为潜在的DHFR抑制剂.

2 结论

本研究以氯乙腈和2-噻吩甲醛为原料, 通过接合经缩合、环合、还原、硝化等步骤合成的两个关键中间体1c和2d, 设计并合成了两个未被文献报道的新型二氢叶酸还原酶抑制剂的衍生物3c和4b.通过本研究合成路线获得的产品收率较好、纯度较高, 并且原料成本低、反应条件温和、操作比较简单、后处理方便.本文采用1H NMR、13C NMR、MS、熔点测定等对其结构进行了确认.此外本文采取MTT比色法对目标化合物及阳性对照药进行了抗肿瘤活性测试, 结果表明3c对5种肿瘤细胞的抑制作用均较明显强于阳性对照药, 4b对肿瘤细胞人肝癌细胞株(Hep-G2)的抑制作用明显强于阳性对照药.而且3c和4b对正常细胞株——人脐带血内皮血管平滑肌细胞(SMC)的抑制活性明显低于阳性对照药. 3c和4b对于肿瘤细胞的抑制作用较强, 可作为先导化合物进行深入的研究, 并且为新型抗肿瘤药的开发研究提供一定的理论依据.

3 实验部分
3.1 仪器与试剂

熔点采用SGW®X-4显微熔点仪(上海精密科学仪器有限公司)测定, 温度未经校正; 核磁共振(1H NMR和13C NMR)由Varian公司的Gemini 2000/300或400 MHz核磁共振仪(上海交通大学化学化工学院分析测试中心和上海侨昌农作物保护有限公司)测定, 以氘代氯仿或氘代二甲基亚砜为溶剂、四甲基硅烷(TMS)为内标; 质谱由Agilent 1100 LC-MSD VL和Thermo Scientific LC-MS[华东理工大学分析测试中心和上海医药(集团)有限公司中央研究院]测定.细胞培养所用CO2培养箱为Thermo Forma Series II生产, 超净工作台为上海新苗医疗器械制造有限公司生产, OD值用酶联免疫监测仪(Thermo MK3)测定.

细胞株SMC、A549、Hep-G2所用培养基为DMEM高糖培养液＋10%的胎牛血清＋1%的青-链霉素双抗溶液配制; 细胞株CCRF-CEM、L1210、SGC-7901所用培养基为RPMI1640培养液＋10%的胎牛血清＋1%的青-链霉素双抗溶液配制所成[所用的试剂除特别说明外, 均为市场销售的化学试剂(分析纯)].柱层层析采用200～300目硅胶(青岛海洋化工厂); 薄层色谱(TLC)采用硅胶GF254薄层层析预制板(上海东方药品科技实业有限公司), 在紫外光下或以碘蒸气显色.

3.2 化学合成方法
3.2.1 关键中间体1c的合成

将甲醇钠(10.8 g, 100 mmol)溶于四氢呋喃(100 mL)中, 冰浴, 加入甲酸甲酯(7.2 g, 120 mmol), 使用滴液漏斗缓慢滴加氯乙腈(7.5 g, 100 mmol), 1.5 h滴加结束.常温反应3 h后, 滴加浓盐酸调节pH至6, 过滤析出的白色固体, 滤饼用四氢呋喃(5 mL×3)洗涤.浓缩滤液得化合物2-氯-3-氧代丙腈(1a)的四氢呋喃溶液, 直接用于下一步反应.

2, 4, 6-三氨基嘧啶(6.66 g, 53 mmol)和三水合乙酸钠(14.00 g, 103 mmol)溶于水(100 mL), 升温至50 ℃, 滴加1a (6.58 g, 64 mmol)的四氢呋喃溶液(15 mL), 搅拌过夜.减压蒸馏除去四氢呋喃, 剩余溶液回流1.5 h.冷却至室温, 过滤, 滤饼依次用水、丙酮洗, 干燥, 得2, 4-二氨基-5-氰基-7H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶(1b):灰色固体, 纯度99.1%, 收率60.0%. m.p.＞300 ℃(文献值[10] m.p.＞300 ℃); 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 11.83 (br s, 1H, 7-NH), 7.70 (s, 1H, 6-H), 6.22 (s, 2H, 4-NH2), 5.92 (s, 2H, 2-NH2); MS (EI) m/z: 174 [M＋H]＋.

1b(52 mg, 0.3 mmol)和活化过的镍(1.5 g)溶于甲酸(5 mL), 升温至80 ℃, 搅拌2 h.冷却, 过滤, 减压蒸馏除去甲酸, 得2, 4-二氨基-5-醛基-7H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶(1c):灰色固体, 纯度98.9%, 收率64.3%. m.p.＞300 ℃(文献值[11] m.p.＞300 ℃); 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 11.94 (br s, 1H, 7-NH), 9.51 (s, 1H, CHO), 7.86 (s, 1H, 6-H), 7.39 (br s, 1H, 4-NH2), 6.92 (br s, 1H, 4-NH2), 5.93 (s, 2H, 2-NH2); MS(ESI)m/z: 178 [M＋H]＋.

3.2.2 关键中间体2d的合成

在50 mL三口烧瓶中依次加入2-噻吩甲醛(6.0 g, 53.6 mmol)和乙酸酐(10 mL), 冷却至5 ℃, 缓慢滴加发烟硝酸(2.5 mL, 59.5 mmol), 室温反应12 h后, 冷却至10 ℃, 滴加冰水(15 mL), 室温搅拌2 h.过滤, 滤饼用水洗, 用无水乙醇重结晶, 得化合物5-硝基-2-噻吩甲醛(2a).

2a(3.0 g, 19.1 mmol)、碳酸氢钠(1.6 g, 19.1 mmol)溶于水(25 mL), 缓慢滴加30%过氧化氢(10 mL), 室温过夜.冰浴, 缓慢滴加浓盐酸, 调节pH＝1.过滤, 滤饼依次用水(1 mL)、乙酸乙酯(0.5 mL)洗, 干燥, 得5-硝基-2-噻吩甲酸(2b), 淡黄色固体, 纯度98.2%, 收率65.6%. m.p. 156～158 ℃(文献值[15] m.p. 157～160 ℃); 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 7.91 (d, J＝4.2 Hz, 1H, 4-H), 7.80 (d, J＝4.2 Hz, 1H, 3-H), 7.20～8.00 (br s, 1H, COOH); MS (ESI) m/z: 174 [M＋H]＋.

2b(5.20 g, 30 mmol)溶于DMF(N, N-二甲基甲酰胺) (300 mL), 冰浴冷却至0 ℃, 依次加入N-甲基吗啡啉(3.7 mL, 33 mmol)和2-氯-4, 6-二甲氧基三嗪(5.80 g, 33 mmol), 搅拌1.5 h.升至室温, 加入谷氨酸二乙酯盐酸盐(8.64 g, 36 mmol), 搅拌8 h.减压蒸馏除去DMF, 剩余混合物用二氯甲烷(300 mL)溶解, 依次用5%碳酸氢钠溶液(40 mL)、水(40 mL)洗, 减压蒸馏除去二氯甲烷, 得N-(5-硝基-2-噻吩甲酰基)-L-谷氨酸二乙酯(2c)[16], 红棕色液体, 纯度98.0%, 收率96.7%. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 7.86 (d, J＝4.2 Hz, 1H, 4-H), 7.58 (d, J＝6.9 Hz, CONH), 7.45 (d, J＝4.2 Hz, 1H, 3-H), 4.68 (m, 1H, glutamate α-CH), 4.15 (q, J＝7.2 Hz, 2H, CH2CH3), 4.25 (q, J＝7.2 Hz, 2H, CH2CH3), 2.47～2.53(m, 2H, glutamate γ-CH2), 2.15～2.29(m, 2H, glutamate β-CH2), 1.25 (t, J＝7.2 Hz, 3H, CH2CH3), 1.30 (t, J＝7.2 Hz, 3H, CH2CH3); MS (ESI) m/z: 359 [M＋H]＋.

2c (10.41 g, 29 mmol)和铁粉(9.8 g, 175 mmol)溶于冰醋酸(250 mL), 升温至50 ℃, 搅拌2 h.冷却至室温, 倾入水-二氯甲烷(V:V＝2:1)混合溶剂(750 mL)中, 搅拌1 h.过滤, 静置分层, 水层用二氯甲烷萃取(100 mL×3), 减压蒸馏除去二氯甲烷, 得N-(5-氨基-2-噻吩甲酰基)-L-谷氨酸二乙酯(2d)[17]:红棕色液体, 纯度98.5%, 收率72.8%. 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 7.17 (d, J＝3.9 Hz, 1H, 3-H), 6.56 (d, J＝7.5 Hz, CONH), 6.07 (d, J＝3.9 Hz, 1H, 4-H), 4.67～4.72(m, 1H, glutamate α-CH), 4.10 (q, J＝7.2 Hz, 2H, CH2CH3), 4.21 (q, J＝7.2 Hz, 2H, CH2CH3), 2.40～2.49(m, 2H, glutamate γ-CH2), 2.07～2.27(m, 2H, glutamate β-CH2), 1.22 (t, J＝7.2 Hz, 3H, CH2CH3), 1.29 (t, J＝7.2 Hz, 3H, CH2CH3); MS (ESI) m/z: 329 [M＋H]＋.

3.2.3 目标化合物3c的合成

1c (0.84 g, 4.7 mmol)和2d (2.60 g, 7.9 mmol)溶于冰醋酸(30 mL), 室温搅拌24 h, 加BH3•Et3N (0.6 mL), 室温搅拌36 h.减压蒸馏除去冰醋酸, 以乙酸乙酯/石油醚(3:1, V:V)重结晶, 得N-{5-[(2, 4-二氨基-7H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶-5-基)甲氨基]噻吩-2-甲酰基}-L-谷氨酸二乙酯(3b), 淡黄色固体, 纯度99.5%, 收率65.5%. m.p. 84～88 ℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 10.65 (br s, 1H, 7-H), 8.21 (d, J＝6.0 Hz, 1H, CONH), 7.50 (d, J＝3.0 Hz, 1H, thiophene 3-H), 7.23 (t, J＝3.6 Hz, 1H, CH2NH), 6.73 (s, 1H, 6-H), 6.12 (s, 2H, 4-NH2), 6.04 (d, J＝3.0 Hz, 1H, thiophene 4-H), 5.53 (s, 2H, 2-NH2), 4.29～4.34(m, 1H, glutamate α-CH), 4.22 (d, J＝3.6 Hz, 2H, CH2NH), 4.01～4.11(m, 4H,2CH2cH3), 2.39 (t, J＝5.7 Hz, 2H, glutamate γ-CH2), 1.99～2.08(m, 2H, glutamate β-CH2), 1.16 (t, J＝5.4 Hz, 3H, CH2CH3), 1.17 (t, J＝5.4 Hz, 3H, CH2CH3); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ: 177.6, 177.5, 167.5, 165.6, 165.0, 163.1, 159.6, 1355.1, 126.8, 122.3, 116.1, 108.6, 100.6, 65.9, 65.4, 57.0, 48.9, 35.6, 31.3, 19.5; MS (ESI) m/z: 490 [M＋H]＋.

3b (65 mg, 0.13 mmol)溶于甲醇(3 mL), 加0.5 mol/L氢氧化钠溶液(2 mL), 室温搅拌72 h.过滤, 减压蒸馏除去甲醇, 剩余溶液用0.5 mol/L盐酸调节至pH＝4, 析出淡黄色固体.过滤, 得N-{5-[(2, 4-二氨基-7H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶-5-基)甲氨基]噻吩-2-甲酰基}-L-谷氨酸(3c), 淡黄色固体, 纯度99.2%, 收率59.1%. m.p.＞300 ℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 10.73 (br s, 1H, 7-H), 8.07 (d, J＝5.7 Hz, 1H, CONH), 7.50 (d, J＝3.0 Hz, 1H, thiophene 3-H), 7.19 (t, J＝3.3 Hz, 1H, CH2NH), 6.75 (s, 1H, 6-H), 6.29 (s, 2H, 4-NH2), 6.04 (d, J＝3.0 Hz, 1H, thiophene 4-H), 5.68 (s, 2H, 2-NH2), 4.28～4.31(m, 1H, glutamate α-CH), 4.23 (d, J＝3.3 Hz, 2H, CH2NH), 2.70 (br s, 2H, 2COOH), 2.31 (t, J＝5.7 Hz, 2H, glutamate γ-CH2), 1.84～2.07(m, 2H, glutamate β-CH2); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ: 174.6, 174.4, 162.7, 160.6, 159.1, 157.8, 154.1, 130.1, 121.7, 117.9, 111.9, 103.9, 95.7, 52.2, 43.9, 31.1, 26.9; MS (ESI) m/z: 434 [M＋H]＋; HRMS (ESI) calcd for C17H19N7O5SNa [M＋Na]＋ 456.1066; found 456.1064.

3.2.4 目标化合物4b的合成

3b (110 mg, 0.22 mmol)、40%乙醛(0.2 mL, 3.54 mmol)溶于乙腈(2 mL), 加氰基硼氢化钠(0.67 mmol)和冰醋酸(0.02 mL, 0.33 mmol), 室温搅拌1.5 h.再加冰醋酸冰醋酸(0.02 mL, 0.33 mmol), 室温搅拌24 h.减压蒸馏除去乙腈和醋酸, 剩余混合物经乙酸乙酯-石油醚(V:V＝3:1)重结晶, 得N-{5-[(4-氨基-2-乙氨基-7H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶-5-基)甲氨基]噻吩-2-甲酰基}-L-谷氨酸二乙酯(4a), 淡黄色固体, 纯度99.2%, 收率53.4%. m.p. 136～138 ℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 11.07 (br s, 1H, 7-H), 8.20 (d, J＝5.4 Hz, 1H, CONH), 7.50 (d, J＝3.3 Hz, 1H, thiophene 3-H), 7.21 (t, J＝3.6 Hz, 1H, CH2NH), 6.82 (s, 1H, 6-H), 6.70 (s, 2H, 4-NH2), 6.42 (s, 1H, 2-NHCH2cH3), 6.05 (d, J＝3.3 Hz, 1H, thiophene 4-H), 4.33～4.35(m, 1H, glutamate α-CH), 4.25 (d, J＝3.6 Hz, 2H, CH2NH), 4.01～4.09 (m, 4H, 2COOCH2CH3), 3.09 (q, J＝5.7 Hz, 2H, 2-NHCH2CH3), 2.39 (t, J＝5.7 Hz, 2H, glutamate γ-CH2), 1.91～2.07(m, 2H, glutamate β-CH2), 1.16, 1.18 (t, J＝5.4 Hz, 3H, COOCH2CH3), 1.11 (t, J＝5.7 Hz, 3H, 2-NHCH2CH3); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ: 172.9, 172.7, 162.8, 162.7, 161.0, 160.7, 130.3, 121.4, 118.2, 112.2, 104.2, 95.4, 61.6, 60.6, 52.3, 46.5, 36.2, 30.8, 26.6, 15.6, 14.7; MS (ESI) m/z: 518 [M＋H]＋.

4a (50 mg, 0.10 mmol)溶于甲醇(2 mL), 加0.5 mol/L氢氧化钠溶液(2 mL), 室温搅拌72 h.过滤, 减压蒸馏除去甲醇, 剩余溶液用0.5 mol/L盐酸调节至pH＝4, 析出淡黄色固体.过滤, 得N-{5-[(4-氨基-2-乙氨基-7H-吡咯并[2, 3-d]嘧啶-5-基)甲氨基]噻吩-2-甲酰基}-L-谷氨酸(4b), 淡黄色固体, 纯度99.1%, 收率69.5%. m.p.＞300 ℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 11.09 (br s, 1H, 7-H), 8.11 (d, J＝6.0 Hz, 1H, CONH), 7.50 (d, J＝2.7 Hz, 1H, thiophene 3-H), 7.22 (t, J＝3.6 Hz, 1H, CH2NH), 6.81 (s, 1H, 6-H), 6.74 (s, 2H, 4-NH2), 6.50 (s, 1H, 2-NHCH2CH3), 6.04 (d, J＝2.7 Hz, 1H, thiophene 4-H), 4.29～4.31(m, 1H, glutamate α-CH), 4.24 (d, J＝3.6 Hz, 2H, CH2NH), 3.25～3.38(m, 2H, 2-NHCH2CH3), 2.31 (t, J＝5.7 Hz, 2H, glutamate γ-CH2), 1.83～2.07(m, 2H, glutamate β-CH2), 1.10 (t, J＝5.7 Hz, 3H, 2-NHCH2CH3); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ: 174.5, 174.4, 162.7, 160.5, 130.1, 121.8, 118.8, 112.7, 104.5, 95.1; MS (ESI) m/z: 462 [M＋H]＋; HRMS (ESI) calcd for C19H24N7O5S 462.1560; found 462.1549.

3.3 抗肿瘤活性测试

本文采用噻唑蓝(MTT)比色法测定目标化合物的体外抗肿瘤活性.选取对数生长期的细胞接种到96孔板, 每孔约5000个, 待测化合物浓度为4、2、0.8、0.4、0.16、0.032 μg/mL六个浓度梯度, 设置双复孔.以MTT显色后, 在570 nm波长下用酶联免疫监测仪测定光密度(OD)值, 按下述公式计算抑制率:

$ {\rm{抑制率}}\left( {\rm{\% }} \right){\rm{ = }}\frac{{{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{空白}}}}{\rm{-O}}{{\rm{D}}_{{\rm{加药组}}}}}}{{{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{空白}}}}}}{\rm{ \times 100\% }} $

运用非线性回归分析计算细胞抑制率达50%时化合物的浓度的平均值, 以IC50值表示, 再通过除以化合物的摩尔质量的方式将单位由μg/mL转换为μmol/L, 方便化合物之间进行对比.

辅助材料(Supporting Information)  中间体1b、1c、2c、2d的1H NMR和MS谱图, 新化合物3b、3c、4a、4b的1H NMR、13C NMR和MS谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

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