English

• 0.   引言

  光热治疗(PTT)利用外部光源将光能转化为热能，通过局部加热的方式杀死病灶组织细胞，具有非侵袭、时空可控、治疗时间短、对健康组织损失小等优点，在肿瘤治疗等领域受到了广泛的关注^[1]。自从Hirsch等^[2]使用金纳米球壳实现了近红外PTT以来，金纳米材料、碳材料、半导体聚合物、金属硫化物、小分子染料等多种材料均被应用于PTT ^[3]。近年来，随着近红外二区(NIR-Ⅱ，1 000~1 700 nm) 技术的研究和发展^[4]，PTT的研究也从近红外一区(NIR-Ⅰ，700~900 nm)转向NIR-Ⅱ。NIR-Ⅱ的PTT具有更深的组织穿透深度和更高的激光最大允许照射强度(1 064 nm下为1 W·cm^-2，而808 nm下仅为0.33 W·cm^-2)，从而展示出更加优秀的治疗效果^[5]。硫化铜(CuS)基纳米颗粒是最早应用于NIR-Ⅱ的PTT的材料之一^[6]，其近红外吸收来自于高载流子浓度带来的表面等离子体共振^[7]，具有极高的吸光系数，并且主要通过非辐射衰减来转换吸收的光能，能够产生高的光热转换效率，是一种很有前景的光热材料^[8]。

  另一方面，近年来诊疗一体化在生物医学领域受到了广泛的关注^[9]。这些强吸光的材料本身也可用于光声成像辅助疾病诊断，但是光声成像在解剖学分辨率和穿透深度方面存在一定的不足，因此研究人员将Gd³⁺、Mn²⁺、Fe³⁺等具有磁共振成像能力的离子借助牛血清白蛋白(BSA)、二乙撑三胺五乙酸(DTPA)等配位到CuS表面，从而实现多模态成像指导的PTT^[10-14]。然而，单纯的PTT在肿瘤复发及穿透深度方面仍有一定的不足，需要结合其他治疗方式从而获得更加理想的疗效^[15]。恰好Fe、Mn等金属离子可以通过芬顿或类芬顿反应将低毒性的H₂O₂转化为高毒性的羟基自由基(·OH)^[16]，用于肿瘤或者炎症的治疗且没有穿透深度的限制，这一过程被称为化学动力学治疗(CDT) ^[17]。尽管Cu也可以用于CDT，但是CuS的溶度积(K_sp)较小，不易释放出金属离子，因此表面螯合的Fe、Mn等金属离子有助于提高材料的CDT能力。尽管这种螯合的方式为CuS的多功能化提供了很多的便利，但是也带来了稳定性差、体内易解离等问题。所以，也有课题组制备了Cu₅FeS₄及CuFeS₂等纳米材料来解决这一问题^[18-19]。但是，这些结构严重影响了CuS的表面等离子体共振强度，使得材料的吸光能力明显下降，进行PTT所需的剂量明显提高，可能造成一定的毒副作用。

  阳离子交换策略是合成多组分金属硫化物并同时保持其晶体结构与形貌的一种有效方法，在金属硫化物纳米结构的合成中扮演了重要的角色^[20]。近年来CdS-Cu_1.8S、ZnS-Cu_1.8S、CoS-Cu_1.8S等具有异质结构的纳米颗粒、纳米棒及纳米片均已成功合成^[21-23]。因此，这种阳离子交换策略可用于特定金属离子在CuS表面的掺杂。在CuS表面掺杂Fe、Mn等元素将赋予纳米颗粒磁共振成像及CDT能力，同时还能保持CuS纳米材料的近红外吸收和较高的结构稳定性，然而目前在相关方面仍未见报道。

  我们首先通过调节硫元素活化溶剂的方式，将所得CuS纳米颗粒的吸收峰移动至1 064 nm附近，使其可用于NIR-Ⅱ的PTT。接着研究了Fe³⁺、Fe²⁺、Mn³⁺、Mn²⁺及Gd³⁺等具有特定功能的金属离子与CuS纳米颗粒的阳离子交换反应，发现Fe³⁺、Fe²⁺、Mn²⁺离子能够被成功掺入CuS纳米颗粒中并保持原有吸收峰位置几乎不变。我们详细对比了Fe³⁺掺杂前后CuS纳米颗粒在光热及化学动力学性能方面的区别。Fe³⁺掺杂的CuS纳米颗粒(CuS∶Fe-PEG)的质量消光系数为37.5 L·g^-1·cm^-1，光热转换效率可达43.7%，略低于未掺杂的CuS-PEG，但是其·OH生成能力远高于未掺杂的CuS-PEG。细胞实验表明，在酸性条件下CuS∶Fe-PEG能够较好地抑制肿瘤细胞生长。再结合1 064 nm激光，CuS∶Fe-PEG能够有效杀死肿瘤细胞，与未掺杂的CuS-PEG相比具有更好的治疗效果，可用于PTT和CDT的联合治疗。另外，Fe³⁺掺杂的CuS也具有光声及磁共振成像能力，在肿瘤的诊疗中具有良好的应用潜力。

  1.   实验部分

  1.1   实验材料

  乙酰丙酮铜(Cu(acac)₂)、乙酰丙酮铁(Fe(acac)₃)、乙酰丙酮亚铁(Fe(acac)₂)、乙酰丙酮锰(Ⅱ)(Mn(acac)₂)、油胺(OM)等购于上海阿拉丁试剂。硫粉、乙醇、氯仿、二硫化碳购于南京化学试剂厂。油酸(OA)、1-十八烯(ODE)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)购于西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)。磷脂化聚乙二醇(DSPE-PEG，M_W=5 000)从上海芃硕生物科技购买。

  1.2   样品表征

  吸收光谱使用岛津公司的UV-3600紫外可见近红外分光光度计进行测试；样品形貌通过日立HT7700透射电子显微镜(TEM)进行表征，加速电压为100 kV；样品的结构通过布鲁克D8 ADVANCE X射线衍射仪(XRD)进行分析，Cu Kα射线(波长0.154 nm)为射线源，工作电压40 kV，工作电流40 mA，扫描速度2 (°)·min^-1，扫描范围20°~80°；元素含量通过配置了X射线能谱仪(EDS)的日立S4800场发射扫描电子显微镜进行表征，加速电压为20 kV；X射线光电子能谱(XPS)通过岛津公司的AXIS SUPRA+进行表征；光热性能通过菲利尔E50红外热像仪进行测试。

  1.3   CuS纳米颗粒的合成

  将64 mg硫粉分散于5 mL OA和5 mL ODE的混合溶液中，在氮气保护下加热至125 ℃，充分溶解后降温至55 ℃。将65.5 mg乙酰丙酮铜在55 ℃下溶于5 mL OM和10 mL ODE中。取5 mL S溶液加入到乙酰丙酮铜溶液中，在氮气保护下升温至120 ℃，并维持反应1 h。冷却后产物用乙醇沉降，离心收集样品，用氯仿/乙醇、二硫化碳/乙醇和乙醇分别洗涤沉淀后，将产物分散在7 mL氯仿中得到CuS纳米颗粒。

  1.4   Fe、Mn掺杂CuS纳米颗粒的合成

  将上述洗涤过的CuS沉淀超声分散在5 mL ODE中。将0.05 mmol乙酰丙酮盐在55 ℃下溶于5 mL OM和10 mL ODE中，完全溶解后加入CuS的ODE溶液。在氮气保护下，将混合溶液升温至120 ℃并保持30 min，加入乙醇沉降并离心洗涤后，将样品分散于7 mL氯仿中得到掺杂的CuS纳米颗粒。使用的乙酰丙酮盐包括乙酰丙酮铁、乙酰丙酮亚铁、乙酰丙酮锰(Ⅱ)、乙酰丙酮锰(Ⅲ)和乙酰丙酮钆。其中，铁(Ⅲ)掺杂的CuS记为CuS∶Fe。

  1.5   纳米颗粒的聚乙二醇(PEG)修饰

  将35 mg DSPE-PEG充分溶解于4 mL去离子水中，将0.5 mL纳米颗粒(CuS或CuS∶Fe)的氯仿溶液滴加到DSPE-PEG的水溶液中，超声后得到微乳液。在60 ℃水浴中蒸发掉氯仿，使用针头过滤器(400 nm)过滤除去沉淀并超滤纯化后得到澄清透明的PEG化纳米颗粒水溶液(CuS-PEG、CuS∶Fe-PEG)。

  1.6   光热性能测试

  配制不同浓度(10、20、35、50 μg·mL^-1)的CuS-PEG和CuS∶Fe-PEG纳米颗粒溶液，使用1 064 nm激光器作为激发光源(功率密度为1 W·cm^-2)照射10 min，通过红外热像仪读取溶液温度。另外，分别测试激光功率密度为0.33、0.56、0.83和1 W·cm^-2时样品的升温曲线。

  1.7   化学动力学效果测试

  使用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)比色法测定CuS-PEG及CuS∶Fe-PEG纳米颗粒的·OH生成能力。首先，将纳米颗粒(10 μg·mL^-1)分散在pH=5.5的磷酸盐缓冲液中(0.01 mol·L^-1，2 mL)，然后加入TMB(0.4 mmol·L^-1)和H₂O₂ (10 mmol·L^-1)，分别在反应0、1、20、30 min时测试溶液的吸收光谱。

  1.8   细胞活性检测

  选用HeLa细胞作为受试细胞，采用噻唑蓝(MTT)法评估了中性和弱酸性条件下材料对肿瘤细胞的抑制效果。在96孔板中加入HeLa细胞(每孔10 000个细胞)并在培养箱中孵育过夜。将CuS-PEG及CuS∶Fe-PEG纳米颗粒用中性(pH=7.2)或弱酸性(pH=5.5)缓冲液稀释成不同的浓度(0、25、50、75、100 μg·mL^-1)后，加入到96孔板中。对于弱酸性样品，再加入H₂O₂(0.1 mmol·L^-1)模拟肿瘤微环境。孵育3 h后，使用1 064 nm激光(1 W·cm^-2)照射5 min并继续孵育4 h，然后加入MTT测试细胞活性。

  2.   结果与讨论

  2.1   CuS纳米颗粒吸收波长的调节

  硫粉在不同溶剂中活化后，会产生不同的含硫活性中间体(图S1，Supporting information)，从而表现出不同的反应活性，使产物的光学性质发生一定的改变^[24]。这里分别以OA、ODE、OM及OA/ODE混合溶剂为硫元素的活化溶剂，制备了4种不同的CuS纳米颗粒，样品的形貌和吸收光谱如图 1所示。硫粉溶于OA时，制得的CuS吸收峰约在970 nm，与文献报道一致^[25]。以ODE和OM为活化溶剂时，吸收峰红移至1 200 nm。由此推测使用混合溶剂活化硫粉，能够实现其吸收峰在一定范围内的调节。当使用OA/ODE混合溶剂(1∶1)时，制得的CuS吸收峰恰好位于1 060 nm，与1 064 nm激光器良好匹配，可用于NIR-Ⅱ的PTT。此时，所得材料呈颗粒状，粒径约为12 nm，适用于各类生物医学应用。

  图 1

  

  图 1.  硫粉溶于OA (a)、ODE (b)、OM (c)及OA/ODE混合溶剂(d)所制得的CuS纳米颗粒的TEM图; 相应材料的吸收光谱图(e); 不同反应温度(f)和反应时间(g)下制得的CuS纳米颗粒的吸收光谱

  Figure 1.  TEM images of CuS nanoparticles prepared with sulfide source dissolved in OA (a), ODE (b), OM (c), and OA/ODE mixed-solvent (d); Corresponding absorption spectra of the obtained CuS nanoparticles (e); Absorption spectra of CuS nanoparticles prepared under different reaction temperatures (f) and reaction times (g)

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  另外，我们对该体系的反应温度和反应时间也进行了一定的优化。在铜源和硫源混合后，分别在55~140 ℃下反应，所得样品的吸收光谱如图 1f所示。在120 ℃下所得CuS纳米颗粒吸收强度最高，为最佳反应温度。当体系温度达到120 ℃后，继续加热可使得样品吸光度逐渐上升，在1 h时达到最高，而后几乎保持不变。因此，选取反应温度120 ℃、反应时间1 h为最佳合成条件。

  2.2   CuS纳米颗粒的掺杂

  为了进一步提高所得CuS材料在诊疗方面的性能，我们尝试通过阳离子交换法对其进行掺杂。主要尝试了Fe³⁺、Fe²⁺、Mn³⁺、Mn²⁺及Gd³⁺等具有CDT或磁共振成像能力的金属离子的乙酰丙酮盐，并通过EDS测试产物的元素组成。结果表明，Fe³⁺、Fe²⁺、Mn²⁺离子能够通过阳离子交换反应掺杂到CuS中(图 2、S2)，其他金属离子则不行，这可能与不同金属离子与硫离子的结合能力不同有关。通过TEM对3种掺杂CuS纳米颗粒进行表征(图 2b、S2c、S2d)，这些纳米材料尺寸较均一，分散性良好。值得注意的是，经过离子交换反应，这些材料的吸收光谱较原CuS变化不大(图S2e)，说明这些材料保留了CuS的NIR-Ⅱ的PTT的能力。

  图 2

  

  图 2.  CuS∶Fe-PEG的合成示意图(a); CuS∶Fe的TEM图(b)、XRD图(c)和EDS谱图(d)

  Figure 2.  Schematic illustration of the synthetic process of CuS∶Fe-PEG (a); TEM image (b), XRD pattern (c), and EDS spectrum (d) of CuS∶Fe

  Inset: the corresponding element contents

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  由于+3价铁相对稳定，我们选择Fe³⁺掺杂的硫化铜(CuS∶Fe)进行后续的分析和应用。EDS测试(图 2d)显示产物中Fe与Cu的原子比为1∶6.17，略低于投料比1∶5，表明离子交换反应只能部分进行。XRD图(图 2c)说明Fe离子掺杂前后样品的晶体结构没有明显变化，均与靛铜矿CuS的标准卡片(PDF No.03-1090)匹配良好。Ding等报道CuS与乙酰丙酮铁在260 ℃下反应会得到CuFeS₂^[19]，而我们在较低温度下反应未观察到CuFeS₂的生成。XPS结果(图S3)验证了样品中Cu、S、Fe元素的存在，且各元素的比例与EDS数据(图 2d)吻合。Fe2p、Fe3s和Fe3p的结合能与文献中Fe³⁺的结合能一致^[26]，因此我们认为Fe元素仍以+3价的状态存在。Fe³⁺的掺杂比例也能够通过改变乙酰丙酮铁的投加量进行调节(图S4)，但是过高的掺杂比例会使产物的近红外吸光能力下降且样品易沉淀。

  2.3   CuS∶Fe的水溶性修饰

  为了实现CuS纳米材料的生物医学应用，采用两亲性的DSPE-PEG包裹的方式对CuS以及CuS∶Fe进行了水溶性修饰(图 2a)。在表面改性之后，CuS-PEG以及CuS∶Fe-PEG能够很好地分散在水溶液中，具体表征如图 3所示。它们的水合直径分别为36.5和44.1 nm，虽然有一定的团聚但是粒径仍在合适的范围之内。这些纳米颗粒在水中能够保持NIR-Ⅱ的吸收，且具有良好的分散性和稳定性，放置一周后吸光度下降幅度小于4%(图 3f)。

  图 3

  

  图 3.  CuS-PEG的TEM图(a)、水合粒径分布(b)及稳定性(c); CuS∶Fe-PEG的TEM图(d)、水合粒径分布(e)及稳定性(f)

  Figure 3.  TEM image (a), hydrodynamic diameter distribution (b), and stability (b) of CuS-PEG; TEM image (d), hydrodynamic diameter distribution (e), and stability (f) of CuS∶Fe-PEG

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  2.4   CuS∶Fe-PEG的光热性能

  CuS-PEG在1 064 nm处的消光系数为38.4 L· g^-1·cm^-1，CuS∶Fe-PEG在1 064 nm处的消光系数为37.5 L·g^-1·cm^-1，数值高于大多数光热试剂(表S1)，这有助于提高光热效果。接着使用红外热像仪监测了纳米颗粒在1 064 nm激光照射下的温度变化(图 4)。浓度仅10 μg·mL^-1的CuS-PEG和CuS∶ Fe-PEG经过1 064 nm激光器(1 W·cm^-2)照射10 min后温度可升至49.3和48.2 ℃，达到有效杀死癌细胞的温度(48~49 ℃)。随着样品浓度的增加，所能达到的温度明显升高，当样品浓度为50 μg·mL^-1时，最终温度分别可达78.1和75.5 ℃。从图 4c和4g可以看出，当浓度一定时，光热效果也会随着激光功率的增大而提升。

  图 4

  

  图 4.  q CuS-PEG (a)和CuS∶Fe-PEG (e)在激光照射后的热成像图; 不同浓度CuS-PEG (b)和CuS∶Fe-PEG (f)在激光照射下的升温曲线; CuS-PEG (c)和CuS∶Fe-PEG (g)在不同功率激光照射下的升温曲线; CuS-PEG (d)和CuS∶Fe-PEG (h)降温曲线中时间与-ln θ的线性拟合曲线

  Figure 4.  Thermal images of CuS-PEG (a) and CuS∶Fe-PEG (e) under 1 064 nm laser irradiation; Temperature increase of CuS-PEG (b) and CuS∶Fe-PEG (f) with different concentrations under laser irradiation; Temperature increase of CuS-PEG (c) and CuS∶Fe-PEG (g) under different laser power densities; Linear fitting curve of time versus-ln θ obtained from the cooling period for CuS-PEG (d) and CuS∶Fe-PEG (h) after laser irradiation

  θ=(T-T₀)/(T_max-T₀), where T is the temperature of the solution, T₀ is the temperature of the surrounding environment, and T_max is the temperature of the solution after laser irradiation

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  这些材料也表现出优秀的光热稳定性，如图S5所示，浓度为50 μg·mL^-1的纳米颗粒经过1 064 nm激光(0.83 W·cm^-2)连续4个光热升温/降温循环，每次都能升温至几乎相同温度。利用降温曲线计算材料的光热转换效率^[27]，CuS-PEG的光热转换效率高达45.2%，在Fe³⁺掺杂后有所下降，但仍可达43.7%(图 4d、4h)。如表S1所示，CuS-PEG及CuS∶ Fe-PEG在NIR-Ⅱ的吸光系数和光热转换效率均高于大多数NIR-Ⅱ光热试剂，都是高效的PTT试剂。

  2.5   CuS∶Fe-PEG的化学动力学性能

  肿瘤内高表达的H₂O₂可以通过芬顿或类芬顿反应被Fe、Cu、Mn等金属离子转化为高细胞毒性的·OH，造成DNA损伤或蛋白失活，从而杀死肿瘤细胞^[28]。这里以TMB为指示剂^[29]，考察CuS纳米颗粒在掺杂前后的·OH生成能力。如图 5所示，加入H₂O₂后混合溶液在650和900 nm处的吸收逐渐升高，表明TMB的氧化和·OH的生成。值得注意的是，CuS∶Fe-PEG在650和900 nm的吸光度提升明显高于CuS-PEG，表明Fe的掺杂能够显著提升CuS的·OH生成能力，这种差异使得CuS∶Fe-PEG更加适合于肿瘤的CDT。

  图 5

  

  图 5.  CuS-PEG (a)和CuS∶Fe-PEG (b)在与TMB和H₂O₂孵育后的吸收光谱图; (c) 孵育后相应样品在650 nm处的吸光度变化

  Figure 5.  Absorption spectra of CuS-PEG (a) and CuS∶Fe-PEG (b) after incubated with TMB and H₂O₂; (c) Change of the absorbance at 650 nm of corresponding samples after incubation

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  2.6   CuS∶Fe-PEG的联合治疗效果

  在HeLa细胞中加入一定量的CuS-PEG和CuS∶ Fe-PEG后，分别进行了光照和不光照的4组对照实验。如图 6a所示，在不光照的情况下，细胞活性随CuS-PEG和CuS∶Fe-PEG浓度的增加而略微降低，但仍能保持在90% 以上，证明这2种材料较好的生物相容性。在1 064 nm激光的照射下，这2种材料表现出明显的细胞抑制能力，表明其优秀的NIR-Ⅱ的PTT能力。在这种正常的孵育条件下，可以看出2种材料对肿瘤细胞的抑制作用没有显著的差异。通常情况下，肿瘤微环境中的H₂O₂浓度可达0.1~1 mmol·L^{-1 [30]}，且呈弱酸性，这些条件都有助于CDT。接下来我们在0.1 mmol·L^-1 H₂O₂和弱酸性的孵育条件下，重新评价了这2种材料的肿瘤细胞抑制能力(图 6b)。首先，我们确认了该孵育条件本身对细胞活性的影响很小，如图S6所示。在这种模拟肿瘤微环境的条件下，CuS∶Fe-PEG展现出比CuS-PEG更好的肿瘤细胞抑制效果，这种差异随着材料浓度的增加而更加明显。1 064 nm激光照射后的细胞活性均大幅下降，相比于CuS-PEG纳米颗粒，CuS∶Fe-PEG处理过的细胞活性更低，说明其更好的联合治疗效果。综上，CuS∶Fe-PEG在肿瘤微环境中，具有更好的抗肿瘤效果，这一现象有利于降低材料对正常组织的损伤，提高肿瘤治疗的特异性。

  图 6

  

  图 6.  HeLa细胞在正常(a)和酸性(b)条件下经不同治疗方法后的细胞活性

  Figure 6.  Cell viabilities of HeLa cells after different treatments under normal (a) and acidic (b) conditions

  ^*p < 0.05, ^**p < 0.01, ^***p < 0.001

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  3.   结论

  通过调节硫元素活化溶剂的方式，成功制备了具有近红外吸收的CuS纳米颗粒，并进一步通过阳离子交换反应获得了Fe、Mn等元素掺杂的CuS纳米离子。PEG修饰之后，Fe³⁺掺杂的CuS纳米颗粒在水溶液中展现出良好的分散性和稳定性，同时保留了优秀的吸光能力和光热转换效率，可用于光热治疗。CuS∶Fe-PEG也表现出显著提升的·OH生成能力，可用于肿瘤的CDT。因此，该材料是一种高效的肿瘤光热/化学动力学联合治疗试剂。另外，强的近红外吸收和铁离子的掺杂也使该纳米颗粒具有了光声及磁共振成像的能力，在肿瘤的诊疗中具有良好的应用潜力。

  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn

  
  
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  图 1  硫粉溶于OA (a)、ODE (b)、OM (c)及OA/ODE混合溶剂(d)所制得的CuS纳米颗粒的TEM图; 相应材料的吸收光谱图(e); 不同反应温度(f)和反应时间(g)下制得的CuS纳米颗粒的吸收光谱

  Figure 1  TEM images of CuS nanoparticles prepared with sulfide source dissolved in OA (a), ODE (b), OM (c), and OA/ODE mixed-solvent (d); Corresponding absorption spectra of the obtained CuS nanoparticles (e); Absorption spectra of CuS nanoparticles prepared under different reaction temperatures (f) and reaction times (g)

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  图 2  CuS∶Fe-PEG的合成示意图(a); CuS∶Fe的TEM图(b)、XRD图(c)和EDS谱图(d)

  Figure 2  Schematic illustration of the synthetic process of CuS∶Fe-PEG (a); TEM image (b), XRD pattern (c), and EDS spectrum (d) of CuS∶Fe

  Inset: the corresponding element contents

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  图 3  CuS-PEG的TEM图(a)、水合粒径分布(b)及稳定性(c); CuS∶Fe-PEG的TEM图(d)、水合粒径分布(e)及稳定性(f)

  Figure 3  TEM image (a), hydrodynamic diameter distribution (b), and stability (b) of CuS-PEG; TEM image (d), hydrodynamic diameter distribution (e), and stability (f) of CuS∶Fe-PEG

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  图 4  q CuS-PEG (a)和CuS∶Fe-PEG (e)在激光照射后的热成像图; 不同浓度CuS-PEG (b)和CuS∶Fe-PEG (f)在激光照射下的升温曲线; CuS-PEG (c)和CuS∶Fe-PEG (g)在不同功率激光照射下的升温曲线; CuS-PEG (d)和CuS∶Fe-PEG (h)降温曲线中时间与-ln θ的线性拟合曲线

  Figure 4  Thermal images of CuS-PEG (a) and CuS∶Fe-PEG (e) under 1 064 nm laser irradiation; Temperature increase of CuS-PEG (b) and CuS∶Fe-PEG (f) with different concentrations under laser irradiation; Temperature increase of CuS-PEG (c) and CuS∶Fe-PEG (g) under different laser power densities; Linear fitting curve of time versus-ln θ obtained from the cooling period for CuS-PEG (d) and CuS∶Fe-PEG (h) after laser irradiation

  θ=(T-T₀)/(T_max-T₀), where T is the temperature of the solution, T₀ is the temperature of the surrounding environment, and T_max is the temperature of the solution after laser irradiation

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  图 5  CuS-PEG (a)和CuS∶Fe-PEG (b)在与TMB和H₂O₂孵育后的吸收光谱图; (c) 孵育后相应样品在650 nm处的吸光度变化

  Figure 5  Absorption spectra of CuS-PEG (a) and CuS∶Fe-PEG (b) after incubated with TMB and H₂O₂; (c) Change of the absorbance at 650 nm of corresponding samples after incubation

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  图 6  HeLa细胞在正常(a)和酸性(b)条件下经不同治疗方法后的细胞活性

  Figure 6  Cell viabilities of HeLa cells after different treatments under normal (a) and acidic (b) conditions

  ^*p < 0.05, ^**p < 0.01, ^***p < 0.001

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