English

• 0.   引言

  铝是地球上储量第三大的金属(约占地球重量的8%)。因其具有低密度、抗腐蚀和导热快等优点，铝制品被人们大量制造及使用，从而导致环境、生物体内Al³⁺过量残留^[1]。研究表明，当人体摄入过高含量的Al³⁺时，会引发许多器官功能障碍，导致相关疾病，如痴呆症、贫血、阿尔茨海默病、骨关节炎等^[2-3]；在水体中过量蓄积的Al³⁺同样会导致水生生物的死亡。因此, 对环境、生物体内Al³⁺的快速检测尤为重要^[4-6]。

  目前，Al³⁺的测定方法主要有原子吸收光谱法、离子色谱法、电感耦合等离子体法等^[7]。其中，荧光探针检测法因具有操作简单快捷、可视性强、识别作用专一性强、灵敏度高、响应时间短、可进行活体分析和在线监测等优点而备受关注^[8]。因此，针对Al³⁺的荧光探针取得了一定进展^[9-10]，现有探针通常利用萘^[11-13]、氟硼二吡咯(BODIPY)^[14]、香豆素^[15-16]或罗丹明^[17-18]作为荧光团，辅以连接基和识别位点构建。然而，这些荧光基团由于较大的分子量与复杂的合成步骤，在检测生物性能与成本上受到一定的限制。相比之下，席夫碱类化合物简便易得^[19]，是目前Al³⁺探针研究的热点。席夫碱结构中的碳氮双键(C=N)可以与Al³⁺配位，从而阻止了C=N的异构化，使得体系荧光增强而实现检测^[20-21]。此外，因Al³⁺具有较高的离子水化能，可在缓冲体系中检测Al³⁺且应用于细胞成像的席夫碱荧光探针数量有限。

  基于此，我们通过一步缩合反应，高效制备了一例席夫碱类荧光探针1(图 1)。在DMSO/H₂O(2∶8，V/V)体系中，探针1可特异性与Al³⁺配位，导致体系荧光显著增强，同时伴随明显的颜色改变。探针1对Al³⁺检测灵敏度高，检出限低至1.44 μmol·L^-1。通过核磁滴定、质谱分析和理论计算研究了探针与Al³⁺的配位模式和荧光传感机理，并将其应用于活细胞内Al³⁺的检测。

  图 1

  

  图 1.  探针1的合成路径

  Figure 1.  Synthetic route of probe 1

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  1.   实验部分

  1.1   试剂和仪器

  所有用于实验合成的试剂都可以通过商业公司进行购买并直接使用，无需进一步的处理与纯化。光谱性质测试中，所有溶剂如二甲亚砜(DMSO) 等为光谱纯试剂，购自Macklin公司，水为MILIPORE处理过的超纯水。元素分析在Vario EL元素分析仪上进行。NMR谱在Bruker AV400 NMR核磁共振仪上测得。荧光光谱在Varian CARY Eclipse分光光度计上测定。电喷雾电离质谱(ESI-MS)在Bruker Daltonics Esquire 6000质谱仪上获得。在Zeiss Leica倒置落射荧光/反射激光共聚焦扫描显微镜上获得荧光图像。pH值用PHS-3精密pH计记录。荧光光谱数据用Origin软件包处理。

  1.2   探针1的合成

  将0.193 g(1 mmol) 4-(二乙氨基)水杨醛和0.103 g(1 mmol)奥肼以100 mL无水乙醇溶解。在250 mL圆底烧瓶内加热回流，90 ℃下反应4 h，点板监测反应过程。反应完成后，冷却至室温，有黄色固体析出，抽滤得到产物并用无水乙醇洗涤，得到黄色固体。¹H NMR(400 MHz，DMSO - d₆)：δ 12.13(s，1H，NH)，11.31(d，J=15.15 Hz，1H，OH)，8.51(d，J=5.05 Hz，1H，CH=N)，8.26(s，1H，NH₂)，7.39(s，1H，NH₂)，7.15~7.99(dd，J=6.07 Hz，2H，NH₂)，6.26(m，3H，Aryl-H)，3.33~3.38(d，J=9.02 Hz，4H，2CH₂)，1.08~1.11(t，J =6.76 Hz，6H，2CH₃)。¹³C NMR(101 MHz，DMSO-d₆)：δ 162.26, 160.37, 156.29, 152.85, 150.92, 132.37, 106.68，104.25，97.85，44.28，12.99。C₁₃H₁₈N₄O₃元素分析计算值(%)：C 56.10，H 6.52，N 20.13；实验值(%)：C 56.18；H 6.28；N 20.24。ESI-MS：m/z=279.151 4 [M+ H]⁺。

  1.3   探针1的光谱性能测试

  将探针1溶于DMSO制得1 mmol·L^-1的探针储备液。探针1的Al³⁺荧光滴定实验检测体系为DMSO-H₂O(2∶8，V/V，pH=7.4)。移取20 μL的探针储备液，加入适量Al(NO₃)₃水溶液(1 mmol·L^-1)，用DMSO定容至5 mL，充分混匀后进行荧光测试。

  1.4   金属离子选择性实验

  金属离子选择性及Al³⁺与碱金属、碱土金属的竞争性实验都在上述DMSO-H₂O体系中进行。将AgNO₃、Al(NO₃)₃、Ca(NO₃)₂、Cd(NO₃)₂、Co(NO₃)₂、CrCl₃、Cu(NO₃)₂、Fe(NO₃)₃、HgCl₂、KNO₃、Mg(NO₃)₂、MnCl₂、NaNO ₃、Ni(NO₃)₂、Pb(NO₃)₂、Zn(NO₃)₂分别溶解，配制成浓度为1 mmol·L^-1的金属储备液。激发波长为390 nm，狭缝宽度为5 nm。

  在探针1对常见金属离子选择性实验中，向2 mL的DMSO-H₂O体系中加入20 μL浓度为1 mmol·L^-1的探针1溶液到比色皿中，依次分别加入60 μL Al³⁺ (1 mmol·L^-1) 和60 μL其它常见金属离子(1 mmol·L^-1)，测定495 nm处的荧光强度。在Al³⁺识别实验中，在2 mL的DMSO-H₂O体系中，取20 μL浓度为1 mmol·L^-1探针1到比色皿中，用微量进样器不断加入Al³⁺溶液，测定495 nm处的荧光强度。在竞争实验中，向2 mL DMSO-H₂O体系中加入20 μL浓度为1 mmol·L^-1的探针1溶液和60 μL浓度为1 mmol·L^-1的Al(NO₃)₃水溶液，然后再分别加入80 μL浓度为1 mmol·L^-1的阳离子溶液：Ag⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺，充分混合后，记录光谱。

  1.5   细胞毒性和成像实验

  选用Hela细胞为研究对象，在培养有Hela细胞的培养皿中分别加入浓度为0、10、20、30和40 μmol·L^-1的探针1，37 ℃下培养24 h后，通过MTT法测定细胞活力。

  将探针1(20 μmol·L^-1)孵育的Hela细胞加入到含有10% 胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中培养30 min，用空白培养基清洗3次，除去过量探针，进行荧光共聚焦成像。加入20 μmol·L^-1的Al³⁺，在37 ℃培养30 min后，再次进行荧光成像。

  2.   结果与讨论

  2.1   探针1对常见金属离子识别

  首先，我们测定了探针1与常见金属离子的荧光响应。在DMSO-H₂O(2∶8，V/V，pH=7.4)的溶液中，探针1(20 μmol·L^-1)在390 nm激发波长下无荧光。当加入Al³⁺后，在495 nm处峰值明显升高，体系荧光强度增加。且在365 nm的紫外灯下，肉眼可观察到溶液由无色变为蓝绿色(图 2a插图)。除Zn²⁺能够引起探针溶液荧光轻微增强(约为加Al³⁺时强度的1/8)，其它离子如Ag⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni²⁺和Pb²⁺，对探针荧光发射无影响。故该探针可实现对Al³⁺的选择性识别。可以作为开启型Al³⁺荧光探针。

  图 2

  

  图 2.  (a) 探针1在无金属离子和加入60 μmol·L^-1不同金属离子后495 nm处的荧光强度; (b) 探针1加入60 μmol·L^-1 Al³⁺后495 nm处荧光强度随时间变化的曲线

  Figure 2.  (a) Fluorescence intensity of probe 1 before and after addition of 60 μmol·L^-1 different metal ions; (b) Time-dependent fluorescence intensity of probe 1 at 495 nm upon treatment with 60 μmol·L^-1 Al³⁺

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  其次，测定了探针1与Al³⁺的反应时间，如图 2b所示。实验结果显示，将探针1溶解到DMSO-H₂体系，加入60 μmol·L^-1的Al³⁺溶液后，其495 nm处的荧光强度随时间的增加明显增强，20 min后荧光强度达到峰值。因此，探针1对Al³⁺的响应时间为20 min。

  2.2   探针1对溶液中的Al³⁺的识别

  我们测试了不同的Al³⁺加入量(每次加入2 μL) 对探针1的荧光光谱的影响，结果如图 3所示。荧光光谱图表明，随着Al³⁺加入量的增大，探针1在495 nm处的荧光强度上升。当加入40 μmol·L^-1的Al³⁺时，495 nm处的荧光强度升为最高；将Al³⁺浓度继续增加至60 μmol·L^-1，荧光强度也基本保持不变。测试了探针1与Al³⁺反应后的荧光强度与Al³⁺浓度的关系。如图 3插图所示，经过线性拟合可得线性回归方程：y=25.908 66+19.748 88x，R²= 0.991 94，说明探针可以定量检测Al³⁺。经计算得出检出限LOD=3σ/k=1.44 μmol·L^-1(σ指空白标准偏差，k是线性方程的斜率)，这远远低于世界卫生组织规定的Al³⁺最高允许水平(7.41 mmol·L^-1)^[22]。

  图 3

  

  图 3.  加入不同浓度的Al³⁺后探针1的荧光光谱

  Inset: the change of fluorescence intensity at 495 nm with the change of the concentration of Al³⁺

  Figure 3.  Fluorescence spectra of probe 1 upon addition of Al³⁺ with different concentrations

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  2.3   探针分子的抗干扰能力

  探针分子在实际应用中容易受到多种因素的荧光强度干扰。如图 4所示，向探针1-Al³⁺体系内分别加入60 μL浓度为1 mmol·L^-1的Ag⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Cr³⁺、Fe³⁺、Hg²⁺、K⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Na⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺，其均对体系荧光发射无明显影响。这一结果说明探针1对Al³⁺的检测具有较强的抗干扰能力。

  图 4

  

  图 4.  竞争离子存在下探针1识别Al³⁺的荧光响应

  Figure 4.  Fluorescence response of probe 1 to Al³⁺ with competition ions

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  2.4   探针1对Al³⁺的识别机理

  通过ESI-MS实验分析了探针1与Al³⁺的反应模式。取1 mg探针溶解在2 mL CH₃OH溶液，加入Al(NO₃)₃ 2 mg，混合20 min后进行ESI-MS测试。如图 5a所示，1+Al³⁺在m/z 321.120 6处出现了新峰，与[Al(1-H)(OH)]⁺(计算值321.117 9，1+Al³⁺)相对应。而m/z=335.137 0、349.110 1和417.098 9处的峰归属于溶剂化离子[Al(1-H) (OCH₃)]⁺ (计算值335.137 9)、[Al(1-H-NH₂+OCH₃) (OCH₃)]⁺ (计算值350.137 9)和[Al(1-H-NH₂)(OCH₃)(NO₃)](计算值416.142 1)。

  图 5

  

  图 5.  探针1和1+Al³⁺的(a) ESI-MS谱图和(b) ¹H NMR谱图(DMSO-d₆)

  Figure 5.  (a) ESI-MS and (b) ¹H NMR spectra (DMSO-d₆) of 1 and 1+Al³⁺

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  为了获得更多关于配合物的信息，我们进行了¹H NMR测试。取5 mg探针溶于0.6 mL的DMSO-d₆中，再加入含5 mg Al(NO₃)₃的DMSO-d₆溶液，等待20 min后进行¹H NMR测试，谱图见图 5b。随着Al³⁺的加入，1的OH质子峰消失，说明探针1的羟基脱氢与Al³⁺配位。同时，探针1的CH=N、NH₂和Ar-H质子峰向低场区轻微位移，证实探针1分子中的亚氨基氮原子以及羰基氧原子参与了配位。根据以上实验结果，推断1通过ONO给体与Al³⁺结合，结合模式如图 6所示。

  图 6

  

  图 6.  探针1与Al³⁺离子反应的可能机理

  Figure 6.  Proposed reaction mechanism of 1 with Al³⁺ ion

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  为了进一步研究探针1与Al³⁺的配位行为，我们用Gaussian 09程序包和B3LYP交换函数进行密度泛函理论(DFT)计算。如图 7所示，探针1的HOMO集中在席夫碱部分，而LUMO主要位于吡嗪基上，这与其微弱的荧光相一致。探针1的C=N异构化在配合物中被抑制，这是导致荧光增强的原因。配合物形成后，电子云扩展到了包括HOMOs和LUMOs在内的整个探针中，这也支持了这一事实。1+Al³⁺的HOMO和LUMO之间的能量差为3.14 eV，低于探针1中HOMO和LUMO的能量差(3.56 eV)。结果表明，1与Al³⁺形成的配合物比1更稳定。

  图 7

  

  图 7.  探针1和1+Al³⁺的优化结构和分子轨道排布

  Figure 7.  Optimized structures and HOMO/LUMO of 1 and 1+Al³⁺

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  2.5   探针1检测细胞中Al³⁺

  为了评价探针1检测生物细胞中Al³⁺的性能，首先进行了探针1的细胞毒性实验。具体实验内容为将浓度为0~40 μmol·L^-1的探针1分别孵育到Hela细胞中24 h，检测Hela细胞的存活率，如图 8所示。实验结果表明，孵育24 h，探针1浓度为40 μmol·L^-1时80%的细胞存活，说明探针1细胞毒性较低。

  图 8

  

  图 8.  MTT法测定的探针1对Hela细胞的毒性

  All samples were done in triplicate; Incubation time: 24 h

  Figure 8.  Toxicity of probe 1 to Hela cells using the MTT assay

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  之后，我们测试了探针1对细胞中Al³⁺的成像。37 ℃下，将10 μmol·L^-1探针1与Hela细胞孵育30 min，绿色通道弱荧光(图 9a)；在相同的条件下补加10 μmol·L^-1的Al³⁺，继续孵育30 min后Hela细胞内绿色通道荧光显著增强，如图 9d所示。因此，探针1能够高效检测细胞中Al³⁺的存在。

  图 9

  

  图 9.  Hela细胞共聚焦荧光图像: (a、b、c) 37℃下, 10 μmol·L^-1探针1孵化Hela细胞30 min; (d、e、f)继续加入10 μmol·L^-1 Al³⁺, 37 ℃孵化该细胞30 min

  (a, d) Green channel; (b, e) Brightfield; (c, f) Overlay

  Figure 9.  Confocal fluorescence images of Hela cells: (a, b, c) Hela cells incubated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min at 37 ℃; (d, e, f) the cells with probe 1 incubated with 10 μmol·L^-1 Al³⁺ for another 30 min at 37 ℃

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  3.   结论

  以4-(二乙氨基)水杨醛和奥肼缩合，合成了一种非常简单的席夫碱类荧光探针1，该探针对Al³⁺具有良好的识别作用，受其他金属离子干扰影响较弱。在DMSO/H₂O(2/8，V/V，pH=7.40)溶液中形成配合物，可引起体系荧光增强，且使溶液颜色由无色变为蓝绿色，可以用于Al³⁺的裸眼识别检测。结合NMR研究表明，配位位点为1中的酚羟基氧原子、亚氨基氮原子以及羰基氧原子。所制备的席夫碱探针1合成简单、对Al³⁺选择性好、检测灵敏度高，并且能在细胞内实现Al³⁺的荧光成像，因此在传感器研制方面具有潜在的应用价值。

  
  
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  图 1  探针1的合成路径

  Figure 1  Synthetic route of probe 1

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  图 2  (a) 探针1在无金属离子和加入60 μmol·L^-1不同金属离子后495 nm处的荧光强度; (b) 探针1加入60 μmol·L^-1 Al³⁺后495 nm处荧光强度随时间变化的曲线

  Figure 2  (a) Fluorescence intensity of probe 1 before and after addition of 60 μmol·L^-1 different metal ions; (b) Time-dependent fluorescence intensity of probe 1 at 495 nm upon treatment with 60 μmol·L^-1 Al³⁺

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  图 3  加入不同浓度的Al³⁺后探针1的荧光光谱

  Figure 3  Fluorescence spectra of probe 1 upon addition of Al³⁺ with different concentrations

  Inset: the change of fluorescence intensity at 495 nm with the change of the concentration of Al³⁺

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  图 4  竞争离子存在下探针1识别Al³⁺的荧光响应

  Figure 4  Fluorescence response of probe 1 to Al³⁺ with competition ions

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  图 5  探针1和1+Al³⁺的(a) ESI-MS谱图和(b) ¹H NMR谱图(DMSO-d₆)

  Figure 5  (a) ESI-MS and (b) ¹H NMR spectra (DMSO-d₆) of 1 and 1+Al³⁺

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  图 6  探针1与Al³⁺离子反应的可能机理

  Figure 6  Proposed reaction mechanism of 1 with Al³⁺ ion

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  图 7  探针1和1+Al³⁺的优化结构和分子轨道排布

  Figure 7  Optimized structures and HOMO/LUMO of 1 and 1+Al³⁺

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  图 8  MTT法测定的探针1对Hela细胞的毒性

  Figure 8  Toxicity of probe 1 to Hela cells using the MTT assay

  All samples were done in triplicate; Incubation time: 24 h

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  图 9  Hela细胞共聚焦荧光图像: (a、b、c) 37℃下, 10 μmol·L^-1探针1孵化Hela细胞30 min; (d、e、f)继续加入10 μmol·L^-1 Al³⁺, 37 ℃孵化该细胞30 min

  Figure 9  Confocal fluorescence images of Hela cells: (a, b, c) Hela cells incubated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min at 37 ℃; (d, e, f) the cells with probe 1 incubated with 10 μmol·L^-1 Al³⁺ for another 30 min at 37 ℃

  (a, d) Green channel; (b, e) Brightfield; (c, f) Overlay

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